2020 Fiscal Year Research-status Report
Functional analysis and application of sulfoglycosidase from mucin-assimilating bacteria
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19K05789
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
加藤 紀彦 京都大学, 生命科学研究科, 助教 (40724612)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
伏信 進矢 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (00302589)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | Bfidobacterium bifidum / ムチン / 糖鎖 / 腸内細菌 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度に引き続き、ヒト常在性ビフィズス菌Bifidobacterium bifidumのムチン分解酵素スルフォグリコシダーゼBbhIIの機能解析を行った。
B. bifidumのin vivoにおけるムチン分解性を検討するため、近交系マウスに本菌を投与し、糞便中ムチンの糖鎖分析を行った。その結果、コントロール群と比べて糖鎖モル量に差は見られなかったものの、短鎖の糖鎖の増加が有意に認められ、本菌が腸管内においてムチン糖鎖を分解することが初めて示された。さらに盲腸内容物中の単糖の分析の結果、B. bifidum投与群においてBbhIIによって遊離されるN-アセチルグルコサミン6硫酸（GlcNAc-6S）の増加が検出された。さらに各糞便の菌叢解析を行い、各サンプルの菌叢データを用いたバイオマーカー探索（LEfSe解析）の結果、Bacteroides属細菌の増加が認められた。これら増加した菌（基準株）のゲノム中にはGlcNAc-6Sの分解に関わる酵素遺伝子ホモログを保持することから、B. bifidumによるムチン分解物がBacteroides属細菌を初めとする腸内細菌によってクロスフィードされる可能性が示唆された。
また、GlcNAc-6SのLC/MSMSによる定量法を確立した。本法によってヒト糞便サンプル中に含まれるGlcNAc-6S量を測定したところ、bbhII遺伝子量との正の相関性を確認することに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究で予定していたマウス実験において、当初の内容とは若干異なるものの、予想していた以上の結果を導き出すことに成功した。すなわち、糞便より抽出したムチン糖鎖分析の結果、菌投与群とコントロール群の間に、ムチン糖鎖の構造的変化を見出すことに成功した。さらには盲腸内容物中の遊離糖の組成変化も検出することに成功するとともに、それら遊離糖が与える腸内菌叢への影響に関する知見を得た。これらの結果は腸内細菌によるムチン分解が菌叢形成に重要な因子であることを直接示す証拠である。さらには、B. bifidumがin vivoにおいてもムチン分解を行うことを示したのは、我々が知る限り本研究が最初となる。
さらには、BbhIIのN末端側に存在する糖鎖結合ドメイン（CBM32）の解析から、ムチン分解における本ドメイン依存性を示すことに成功した。この結果に関連し、さらにB. bifidum等のムチン指向性を持つCBMの豊富なムチン分解性菌グループと、一方でCBMの少ないムチン分解性菌グループでは、ムチン分解様式に大きな違いが存在する可能性を指摘するに至った。本結果は新しい腸内細菌の分類指標を提示している。
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| Strategy for Future Research Activity |
これまでの研究結果を受けて、今後は、ヒトサンプル・データセットを用いた解析を行い、ヒト腸管におけるBbhIIの機能性やB. bifidumのムチン分解の影響を評価する。すなわち、例えば新鮮なヒト糞便にムチンからBbhIIによって遊離するGlcNAc-6Sを一定濃度で添加し、培養した後にどのような菌叢変化が見られるかについて検討する。また、すでにデータベース上に公開されている菌叢データについて、bbhII遺伝子と相関性のある菌に関してデータマインイングを行い、ヒトにおける本酵素の役割と重要性について考察を試みる。
さらに、改変型BbhII変異体（グライコシンターゼ酵素）の作出を引き続き行い、より高効率に硫酸化糖鎖の合成が可能な酵素の取得と酵素化学法による硫酸化糖鎖合成法の開発を試みる。
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