2019 Fiscal Year Research-status Report

油脂酵母を用いたオートファジーによる脂肪滴分解機構の解析と油脂高蓄積酵母の作出

Research Project

Project/Area Number	19K05801
Research Institution	Nigata University of Phermacy and Applied Life Sciences
Principal Investigator	山崎晴丈新潟薬科大学, 応用生命科学部, 助教 (20456776)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	Lipomyces starkeyi / 油脂酵母 / トリアシルグリセロール / 脂肪滴 / オートファジー
Outline of Annual Research Achievements	細胞はエネルギーを脂肪滴に含まれるトリアシルグリセロール（TAG）として蓄積し，必要に応じて分解して利用する必要がある。このTAGの分解には，主として細胞質に局在するリパーゼによる経路が機能すると考えられてきた。最近になり脂肪滴TAGの分解にオートファジーの経路も関与することが明らかとなりつつある。本研究では，植物と似た脂肪酸組成のTAG を高度に（菌体乾燥重量の70％程度まで）蓄積する油脂酵母 Lipomyces starkeyi を用いてオートファジーによる脂肪滴の分解機構を解明することを目的とした。TAG分解に関わる経路が同定されれば，その経路を抑制することで，食料・エネルギー産業利用に資するような，TAGをさらに多く蓄積した酵母を作出することができるか検討することも目的とした。本年度は，既知のマクロオートファジー経路がL. starkeyiのTAG分解に関与しているかを検討した。具体的には，伸長中の隔離膜と小胞体の接点に局在しているとされ，隔離膜の伸長に必要なリン脂質を小胞体から直接運搬している役割を持っているAtg2の欠失株を作製し，その油脂蓄積性を油脂の蓄積に適したS5%培地を用いた培養で調べた。その結果，Δatg2は野生型株(WT)と比べて細胞あたり最大2.2倍多くTAGを蓄積した。Δatg2は6日目以降からグルコースが消費されず、13日目の生菌数はWTと比べ低かった。以上の結果からΔatg2はマクロオートファジーが欠損したことにより、Δatg2は多量のTAGを蓄積すると考えられた。このことからΔatg2は油脂生産の産業への利用価値が高いと考えられた。培地中に利用可能なグルコースが存在するにも関わらず菌が死滅することに関しては，マクロオートファジーの欠損により窒素源等の必須栄養素のリサイクルが機能していない可能性が考えられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason マクロオートファジーに関与するATG2がLipomyces starkeyiのTAG分解に関与している可能性があることを明らかにし，されにATG2を欠失することで野生株に比べて細胞当たりのTAG量が2.2倍にまで増加したことは，この酵母の産業利用の観点からも，予想以上の進展があったといえる。但し，ミクロオートファジーなど他のオートファジー経路の関与については，それを担う遺伝子の破壊株作製が出来ておらず，予想より遅れている。総合して，概ね順調に進展していると判断した。
Strategy for Future Research Activity	マクロオートファジー経路に関与する他の遺伝子も破壊して，その株をATG2破壊株と同様に調査することで，L. starkeyiがTAG分解をマクロオートファジー経路によって分解しているかの更なる検討を加える。またミクロオートファジー経路に関与する遺伝子についても同様に調査を進める。また野生型株や各種破壊株において，脂肪滴に局在するErg6などの蛋白質にGFPタグを付けオートファジーの指標とすることで，どの経路，時期において脂肪滴が分解されるのかを検討する。またErg6にタグを付けた株の細胞抽出液に対して，そのタグを標的として免疫沈降を行い，それを質量分析に供することで，TAG分解が誘導される時に特異的に脂肪滴に局在化する因子を同定する。
Causes of Carryover	ミクロオートファジーの経路に関連する遺伝子破壊株が作製できなかったため，脂肪滴に局在化するErg6などの蛋白質にGFPなどのタグが付いた株の作製が遅れていたため，繰越が生じた。次年度は作製予定だった株をまずは作製する。また脂肪滴に局在化するErg6などの蛋白質にGFPなどのタグが付いた株の細胞抽出液に対して，そのタグを利用した免疫沈降を行い，それを質量分析に供することにより，脂肪滴のTAGの分解時期に特異的に脂肪滴に局在化する蛋白質の同定を行う。