新規好気性アンモニア酸化反応の分子メカニズム解明に向けた触媒分子の分離と機能解明

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05805
• Research Institution: Nagaoka National College of Technology
• Principal Investigator: 押木 守 長岡工業高等専門学校, 環境都市工学科, 准教授 (90540865)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: アンモニア酸化古細菌 / AOA / 硝化 / 触媒分子

Outline of Annual Research Achievements

今年度はアンモニア酸化古細菌(以下、AOA)の大量培養に取り組んだ。まず、3Lスケールで膜分離型リアクターを運転し、AOAの一種であるNitrososphaera viennensisの培養を試みた。膜分離に用いる膜ユニットには中空糸メンブレンを用い、培地を連続的に供給・排出しながらNs. viennensisの培養を行った。リアクター内のpH調整は行わなかったが、培地へpH緩衝剤HEPESを添加することでpHを中性付近で一定に保った。半年間の連続運転を行い、フラスコ内で培養した際と比較して、Ns. viennensisの菌体密度を約10倍高い条件で培養することに成功した。この結果から、膜分離型リアクターを用いることでNs. viennensisを高密度に培養することができ、フラスコ培養と比較して、同じ菌体量を得たい場合には1/10程度スケールダウンできることが確認された。膜分離型リアクターを3Lからさらにスケールアップするため、200Lスケールでの膜分離型リアクターの運転について検討を進めている。
触媒分子の分離・同定について予備検討を進めるため、3Lリアクターで培養した菌体を採取し、菌体破砕液の調整、液体クロマトグラフィーによる精製条件を検討した。菌体破砕について、フレンチプレスと超遠心分離法を組み合わせることでAOA菌体から可溶性画分、膜画分を回収した。さらに膜画分については、各種界面活性剤(コール酸Na、CHAPS、Triton-X、n-オクチルグルコシド)を用いて膜タンパク質の可溶化条件の検討を行った。可溶性画分、可溶化膜タンパク質画分についてNative、SDS-PAGEを行い、ドミナントなタンパク質の発現と分子量の分布をおよそ把握することができた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度ではタンパク質分離のための菌体の確保とタンパク質分離条件の予備検討を当初目的としていた。菌体の確保については、膜分離型リアクターを用いることでフラスコ培養よりも高効率に培養できることを明らかにしており、順調に進展している。タンパク質分離については、菌体破砕条件、膜画分の可溶化条件を明らかにし、液体クロマトグラフィーによる精製に取りかかれる段階まで進めることができた。以上の進捗より、おおむね順調に進展していると判断した。

Strategy for Future Research Activity

本年度（2年目)は、Ns. viennensiの培養をさらに大型スケール(200L)で行い、液体クロマトグラフィーによるタンパク質精製に十分な菌体を安定して供給できる体制を確立する。また、液体クロマトグラフィーについては、可溶性画分および可溶化膜タンパク質画分それぞれについて各種精製担体を用いた分離試験を行い、各担体との相性を検討する実験を計画している。

Causes of Carryover

当初計画では初年度に液体クロマトグラフィー担体を購入する予定であったが、この購入を2年度へ繰り越したたため次年度使用額が生じている。