2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of inhibitor evaluation system for channel proteins based on cell-free system
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19K05815
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
野澤 彰 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 講師 (30432800)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | コムギ無細胞系 / 脂質平面膜法 / ナトリウムチャネル / クロライドチャネル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々はこれまでにコムギ無細胞系にリポソームを添加することで機能的な膜輸送体タンパク質をリポソーム上に合成する技術の開発を行ってきた。本研究では、我々が独自に開発してきたこのコムギ無細胞合成系を基盤とした膜タンパク質調製技術と、電気生理学的手法を融合させることで、汎用性の高いin vitroチャネル解析システムの構築を試みる。再現性の高い微量活性検出システムの構築は、イオンチャネルを標的とした薬剤スクリーニング系の開発に繋がるものと期待している。
本研究ではヒトのナトリウムチャネルとクロライドチャネルをモデルタンパク質として使用した。まずはコムギ無細胞系でこれらのタンパク質が合成できること、また合成されたタンパク質がリポソーム膜上に合成されていることを確認した。本研究では、これらのタンパク質のチャネル活性を、Nanion Technologies社のOrbit miniを利用して検出することを試みた。Orbit miniを利用することで脂質平面膜法によりチャネル１分子の輸送活性を電流として計測することが可能となる。ナトリウムチャネルのナトリウムイオン輸送活性の検出を試みた。その結果、Orbit miniで輸送活性に由来すると考えられるシグナルを観察できた。このシグナルがナトリウムチャネルの輸送活性に由来するのかを検討するために、阻害剤の効果を検討したところ阻害剤の添加によりシグナルの消失が確認されたことから、Orbit miniを利用することでナトリウムチャネルの輸送活性を検出できたと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究ではヒトのナトリウムチャネルとクロライドチャネルをモデルタンパク質として使用し、脂質平面膜法で輸送活性を検出することとその活性の薬剤による阻害効果検討系を開発することを目標に研究を開始した。初年度の今年は、コムギ無細胞系でこれらのタンパク質が合成できること、また合成されたタンパク質がリポソーム膜上に合成されていること、また、Orbit miniを利用することでナトリウムチャネルの輸送活性の検出までを達成できたことからおおむね順調に進展していると評価している。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度はモデルタンパク質であるナトリウムチャネルとクロライドチャネルの合成確認とナトリウムチャネルに関しては、活性の検出までを達成できた。しかし、チャネル活性の検出に関しては、検出できる頻度が数回の測定に１回と低いことから今後は検出頻度を上昇させる必要がある。膜を構成する脂質を検討することで平面膜とリポソームとの融合頻度を増加させ、検出頻度の上昇を図る方向で検討していく予定である。また、クロライドチャネルの方もナトリウムチャネルと同様に進めていく予定である。
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| Causes of Carryover |
業者に依頼したクロライドチャネル遺伝子の合成が失敗したために、遺伝子合成に計上していた予算を消化できなかった。今年度は、遺伝子の配列を変えて合成を依頼する、もしくは別の業者に依頼することで同遺伝子の合成をもう一度行う予定である。
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