2021 Fiscal Year Annual Research Report
Development of inhibitor evaluation system for channel proteins based on cell-free system
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19K05815
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
野澤 彰 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 准教授 (30432800)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | コムギ無細胞系 / 脂質平面膜法 / ナトリウムチャネル / クロライドチャネル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、コムギ無細胞系にリポソームを添加することで機能的な膜輸送体タンパク質をリポソーム上に合成する技術の開発を行ってきた。本研究では、我々が独自に開発してきたこのコムギ無細胞合成系を基盤とした膜タンパク質調製技術と、電気生理学的手法を融合させることで、汎用性の高いin vitroチャネル解析システムの構築を試みた。再現性の高い微量活性検出システムの構築は、イオンチャネルを標的とした薬剤スクリーニング系の開発につながるものと期待される。
本研究では、ヒトのナトリウムチャンネルとクロライドチャネルをモデルタンパク質として使用した。初年度は、これらのタンパク質を合成するためのプラスミドを構築し、これらのタンパク質が無細胞系で合成できること、また合成されたタンパク質がリポソーム膜上に合成されていることを確認した。２年目には、Nanion Technologies社のOrbit Miniを利用して、無細胞系で合成したこれらのタンパク質のチャネル活性の検出を試みた。Orbit Miniを利用することで脂質平面膜法によりチャネル１分子の輸送活性を電流値として計測することが可能となる。まずはナトリウムチャネルの輸送活性の検出を試みた。ナトリウムチャネルは200kDaを超える巨大なタンパク質で無細胞系での合成効率が低かったが、合成途中でmRNAを添加する方法により合成効率が改善され、平面膜法での輸送活性の検出にも成功した。また特異的阻害剤を用いた実験により、輸送に伴い発生する電流値がナトリウムチャネル由来のものであることを確認できた。３年目には、クロライドチャネルの輸送活性の検出を試みた。何通りものサブユニットの組み合わせを試してみた結果、いくつかの組み合わせで無細胞系での共合成により調製したチャネルにおいて活性を検出することに成功した。これらの活性も特異的阻害剤を用いて検証を行った。
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