2019 Fiscal Year Research-status Report
Photo-regulation of mitotic kinesin Eg5 function using photochromic inhibitors which have multiple photo-switching states
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19K05818
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| Research Institution | Soka University |
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Principal Investigator |
丸田 晋策 創価大学, 理工学部, 教授 (40231732)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 機能性抗癌剤 / キネシン / 光制御 / フォトクロミック分子 / 分子モーター / 細胞有糸分裂 / アゾベンゼン / スピロピラン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
キネシン Eg5 は、微小管をレールとして駆動するATP 駆動型のモーター蛋白であり、細胞有糸分裂に関わる重要な役割を担っている生体分子機械である。Monastrol 、STLCなどの特異的阻害剤は、Eg5 による有糸分裂を停止させて、アポトーシスを誘導することが示されており、抗ガン剤として注目されている。またその阻害の分子機構は明らかにされている。 我々は、これまでにアゾベンゼンなどのフォトクロミック分子の誘導体が、これらの阻害剤を模倣して光可逆的にEg5の機能を阻害することを明らかにした。本研究の目的は、二種類のフォトクロミック分子であるアゾベンゼンとスピロピランをカップリングさせることにより、複数の光異性化状態を形成する多段階光スイッチ機構を持つEg5制御デバイスを開発して、 キネシンEg5の活性を自在に光制御する。そして、細胞レベルでEg5の機能を光可逆的に操り、細胞機能を制御することである。
フォトクロミック化合物としてスピロピランとアゾベンゼン誘導体を用いて、複数の異性化状態を示す新規Eg5阻害剤、スピロピランスルホアゾベンゼン（SPSAB）を合成した。 SPSABは、それぞれVIS、UV、およびin the darkで、SP-Trans、MC-Cis、MC-Transの異なる3つの異性化状態を示した。 SPSABのin vitro実験の結果によると、Eg5活性は、上記の研究の目的として、強く、弱く、中程度に正確に制御されていることが示唆されています。 SPSABの3つの異性化状態の中で、SP-Trans異性体は、基礎およびMT依存ATPaseアッセイの両方で強力な阻害活性を示した。また、ドッキングシミュレーションにより、Eg5モータードメイン上のSPSABの可能な結合部位の分析を行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
これまでに、2つのフォトクロミック分子であるアゾベンゼンとスピロピラン誘導体を連結させることにより、理論的に異なる4つの光異性体を形成するキネシン Eg5阻害剤候補化合物を合成することに成功した。この化合物は、紫外線照射、可視光線照射そしてin the darkに置くことにより可能な4つの異性体中の3つの異性化状態を形成した。光異性体間の移行する光波長や照射時間などの詳細な条件を明らかにした。最も重要な結果として、これらの異なる3つの異性体は、キネシンEg5のATPase活性とモーター活性を異なる作用強度で阻害した。このことから、本研究計画の目的である多段階スイッチ機構を持つ有糸分裂キネシン Eg5阻害剤の開発が具体的に可能である結果を示すことができた。従って、2019年度の研究計画は、おおむね順調に進展していると考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後の研究計画は次の通りである。
1.[ 阻害機構の解明] 今回合成した光異性化状態に伴い3段階の作用強度を持つ有糸分裂キネシンEg5阻害剤が、各異性化状態でキネシン Eg5のATP加水分解サイクルのどのステップに影響を与えているか、速度論的な分析を行う。そのために、次の2つの実験を実施する。(1) 速度論的解析: 蛍光標識ATP誘導体とStopped Flow装置を用いて速度論的解析を行い、ATPの結合とADPの解離速度に及ぼす阻害剤の光異性体の影響を明らかにする。 (2)混合キネシン 運動活性測定: In vitro motility assay の確立した方法に従って、従来型キネシン とキネシン Eg5を共存させた状態で、微小管の滑り速度を測定する。この時、多段階スイッチ機構を持つ阻害剤の各異性体がどのような影響を与えるかを測定することにより、微小管とEg5が結合した状態を阻害しているか、微小管から解離した状態を阻害しているか明らかにする。
2. [阻害剤結合部位のドッキングシミュレーション解析] In silicoによる解析でキネシン Eg5上の可能な結合部位におけるドッキングシミュレーション解析を行う。
3. [細胞分裂への効果] Hela細胞を用いて多段階スイッチ機構を持つ阻害剤が及ぼす細胞分裂へ光可逆的な影響を解析する。
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| Causes of Carryover |
目的の化合物を比較的に容易に既存の試薬を用いて合成することができたため、当初予定していた有機合成関係の消耗品費をあまり使用する必要がなかった。研究計画が順調に進んでおり、既存の機器で研究を進められていることもあり本年度は費用を抑えることができた。翌年度では、合成した化合物を用いたキネシんEg5の本格的な制御実験を開始する予定であり、新しい試薬や器具を必要とするので、翌年度分請求助成金に本年度の余った額を合わせて使用する必要がある。
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Research Products
(3 results)
