2021 Fiscal Year Research-status Report
ナス科植物をモデルとしたペルオキシソーム輸送体ABCD1の機能解析
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19K05820
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| Research Institution | Kobe Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
士反 伸和 神戸薬科大学, 薬学部, 教授 (20547880)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
肥塚 崇男 山口大学, 大学院創成科学研究科, 准教授 (30565106)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | タバコ / ペチュニア / ABCD1 / ペルオキシソーム / 輸送体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物の様々な一次、二次代謝産物は、オルガネラ間を動きながら複雑な経路を介して生合成されている。中でもペルオキシソームは、ジャスモン酸（植物ホルモン）やベンゼノイド（特にペチュニアなどの芳香族化合物）、ニコチン（タバコアルカロイド）などの生合成に関わっており、その中間体輸送にはABCD1輸送体が関与することが示唆されているが、その輸送機能の証明や環境応答などの知見はほとんどない。本研究では、ペチュニアとタバコを材料に、植物ABCD1の機能解明を目指している。
本年度は、前年度までの培養細胞やペチュニア組織での発現データの再現性を確認した。ペチュニアとタバコ（シルベストリス）でのABCD1発現抑制体の作出や解析を継続した。また、輸送解析を目的に昆虫細胞Sf9での発現を試みたが、ウイルスの作成はできているもののタンパクレベルでの発現を確認できなかった。そこで発現系をピキア酵母とタバコBY-2細胞に移し、pPIC3.5KやpTA7001-DESTを用いてベクター構築を行った。さらに形質転換を行い、それぞれ形質転換体の作出に成功したが、ピキア酵母においては、タンパク泳動において40 kDa以上のタンパク質がSDS-PAGEでうまく流れない現象が観察され、発現を確認できなかった。現在、泳動条件の改善を進めている。一方、BY-2細胞においては、タバコABCD1-GFP（170 kDa前後）を誘導発現するラインを見出すことに成功した。まだ１ラインのみであることから、ライン数を増やし、誘導時の代謝物変化や、輸送活性解析などを進めていく予定である。また、発現変化についても現在、論文化を目指している。これら解析を進め、植物ABCD1の機能解明を目指す。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
4: Progress in research has been delayed.
Reason
本年度は昆虫細胞に発現させたABCD1の輸送解析を行う予定であったが、感染させるウイルス量を調整するなどいくつか試みたが発現を確認することができなかった。そのため、発現系を変える必要が生じ、ピキア酵母やBY-2細胞発現用のベクター構築、形質転換を行なっていたため、解析が遅れている。ただし、少なくともBY-2においては発現していると考えられるラインが取れていることから、少なくとも代謝物変化は次年度には進めることができると期待される。できればピキア酵母でも発現を確認し、輸送解析を進めることで、遅れを取り戻すとともに、植物ABCD1の役割の解明を目指す。
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| Strategy for Future Research Activity |
ABCD1-GFPの発現が観察されたBY-2においては、ライン数を増やすことが必要であり、デキサメタゾンで誘導した際に発現するラインの選抜をまず進める。複数のラインを得られたら、それら細胞の生育を揃え、デキサメタゾン誘導あり/なしでの各タイムポイントでのサンプリング、代謝物抽出、orbitrapによる代謝物変化の解析を行なっていく。それら解析結果と、タバコやペチュニアでのABCD1発現抑制体の結果とを関連して機能を推定していく。
ピキア酵母においては、40 kDa以上のタンパク質がSDS-PAGEで流れないことが観察されているが、界面活性剤による改善を期待し、抽出タンパク質または抽出時に界面活性剤を添加して検討する。条件は、ピキアでヒトABCD4を発現させ活性を報告している川口博士らの論文を参考にする。発現を確認できたら、膜ベシクルを作成し輸送解析を進める。
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| Causes of Carryover |
昆虫細胞での発現が想定通りにうまくいかず、実験に遅れが生じました。また、発現解析についても論文化を目指していましたが、採択まで至っておらず、掲載料の分などで次年度使用額が生じています。次年度においては、ピキア酵母やタバコBY-2細胞での解析を進めるために使用するとともに、それら成果を論文化するために使用していく予定です。
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