2019 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of yeast TRPY1 channel which convert physical stimulations into biochemical signals.
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19K05823
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
浜本 晋 東京大学, 生物生産工学研究センター, 特任助教 (10533812)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 出芽酵母 / Ca2+ / イオンチャネル / 高浸透圧ストレス応答 / 液胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
出芽酵母液胞膜に発現する陽イオンチャネルTRPY1は、真核生物に広く保存されているTRP (Transient Receptor Potential)チャネルの原型として考えられている。本イオンチャネルは、高浸透圧、酸化還元、機械刺激、Ca2+などの様々な刺激に応答するセンサーの機能を有している。これらの刺激を感知したTRPY1は液胞内に高濃度に蓄積されたCa2+を細胞質に放出している。ホスファチジルイノシトール二リン酸 {PI(3,5)P2} の合成酵素Fab1の欠損株では、TRPY1による高浸透圧に応答したCa2+放出が観察されないことから、TRPY1の活性化にPI(3,5)P2が必要、もしくはPI(3,5)P2の前駆体であるホスファチジルイノシトール一リン酸 {PI(3)P} の蓄積がTRPY1を阻害していることが推察された。そのため。電気生理学的解析方法の一つであるパッチクランプ法を用いてTRPY1の活性測定を行なったところ、PI(3)P処理によってTRPY1の活性化が低下した。このことより、PI(3)Pの蓄積がTRPY1の活性を抑制することが示唆された。さらに、高浸透圧ストレスによって生じるシグナルのTRPY1への伝達機構を明らかにするために、微小管重合阻害剤を用いて高浸透圧ストレス応答を観察したところ、微小管重合阻害剤で処理した出芽酵母では高浸透圧誘導性のCa2+の放出が減少した。このことより、高浸透圧ストレスは微小管によってTRPY1に伝達されることが示唆された。
TRPY1チャネルのシステイン残基をセリン残基に置換した変異チャネルを用いて還元剤による活性化の有無を確認したところ、細胞質領域に露出したC末端に存在するシステインが還元剤による活性化に重要であることを見出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
TRPY1による高浸透圧応答に関わる生体分子を明らかにすることを目的にした網羅的な解析を行う。Ca2+の発光検出を行うために、イクオリン遺伝子をクローニングしたプラスミドを出芽酵母の一遺伝子破壊株コレクション（約6000株）に導入してスクリーニングを行う。現在、約4000株へのプラスミドの導入が完了しており、残りの約2000株へのプラスミドの導入は約2ヶ月程度で完了する予定である。イクオリン遺伝子を導入した遺伝子破壊株コレクションを用いることにより、TRPY1の高浸透圧応答の研究以外にも細胞膜に発現するイオン輸送体を介したCa2+の流入経路およびその下流のCa2+シグナルの伝達機構の研究ツールとしても期待できる。2019年度中に全株へのプラスミドの導入を完了する予定であったが、出芽酵母遺伝子破壊株コレクションの輸入が予定よりも2ヶ月遅れているが、並行してプラスミドの導入が終わっている株からアッセイを進めており、高浸透圧に応答しない変異株が幾つか見出されている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ホスファチジルイノシトールリン酸類がどのようにTRPY1の活性に影響を及ぼすのか直接的に解析するために、PI(3,5)P2生合成不全株（fab1欠損株, vac7欠損株, vac14欠損株）を用いてパッチクランプ解析を行う。さらに、PI(3)P、PI(3,5)P2だけではなく、PI(4)P、PI(4,5)P2の影響を検討するため、PI(4)P合成遺伝子lsb6欠損株を持ち用いたパッチクランプ解析を行う。PI(4,5)P2生合成遺伝子mss4は必須遺伝子であるため遺伝子破壊株は存在しない。そのため、mss4過剰発現株を用いた機能解析を行う。
微小管形成阻害剤を用いることにより出芽酵母の高浸透圧応答が減少したが、微小管の脱重合が実際に生じているかは確認されていない。そのため、微小管と相互作用するABP140タンパク質のN末端ペプチド17残基を緑色蛍光タンパク質に結合させた融合タンパク質を出芽酵母に発現し、微小管阻害剤によって誘導された脱重合をイメージング観察する。
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| Causes of Carryover |
（理由）2019年度に実施した電気生理学的測定により、酵母液胞膜から未知のイオン電流を検出したため、予定していた遺伝子に加えてさらに複数の遺伝子を同時に破壊する必要が生じた。2019年度に予定していた遺伝子破壊を次年度に行うために、2019年度に購入を予定していた遺伝子工学試薬を次年度に購入することとした。さらに、遺伝子破壊株を用いた電気生理学的解析を翌年度に行うために、電気生理学的実験用消耗品と酵母培養用培地を翌年度に購入する。
（使用計画）電気生理学的実験によるイオンチャネル活性の測定を予定しているため、ガラス器具、プラスチック器具、電子部品を消耗品として購入する。電気生理実験に用いる巨大化酵母の調製などに必要となる培地試薬、化学薬品、酵素試薬などの消耗品を購入する。遺伝子破壊株の作成、遺伝子発現量の確認のための遺伝子工学試薬を購入する。成果発表となる国際誌への論文投稿をめざし、英文校正代と投稿料を必要とする。国内の学会と国外の学会に積極的に参加し、本研究の成果を発表するために出張経費が必要となる。
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[Journal Article] The mechanosensitive channel YbdG from Escherichia coli has a role in adaptation to osmotic up-shock.2019
Author(s)
Shun Amemiya, Hayato Toyoda, Mami Kimura, Hiromi Saito, Hiroshi Kobayashi, Kunio Ihara 3 , Kiyoto Kamagata 4 , Ryuji Kawabata 5 , Setsu Kato, Yutaka Nakashimada, Tadaomi Furuta, Shin Hamamoto, Nobuyuki Uozumi
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Journal Title
Journal of Biological Chemistry
Volume: 294 (33)
Pages: 12281-12292
DOI
Peer Reviewed
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