2020 Fiscal Year Research-status Report
GH30 β-1,6-グルコシダーゼの構造機能解析と有用糖質合成への応用
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19K05826
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
磯野 直人 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (70378321)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
勝崎 裕隆 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (10262990)
三宅 英雄 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (50362364)
梅川 碧里 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (60633097)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | GH30 / β-グルコシダーゼ / グライコシンターゼ / ゲンチオビオース |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Halobacillus halophilus由来のGH30酵素(HhGH30A)と活性化Sepharose 4Bを共有結合によりカップリングした固定化酵素を調製した。基質溶液容器→ポンプ→固定化酵素カラム→基質溶液容器の順に連結した循環装置を作製し、恒温器(50 ℃)の中に設置した。基質溶液として4 M グルコースを用いて約1日間、縮合反応を行なったところ、0.3 Mのゲンチオビオースが得られた。また、固定化したGH30酵素は繰り返しの利用においても非常に安定した活性を示した。このように、GH30 β-1,6-グルコシダーゼを利用したゲンチオビオースの効率的な製造装置を作製することに成功した。
HhGH30Aの求核触媒残基であるグルタミン酸をグリシン、アラニン、セリンに置換したグライコシンターゼを作製した。このうち、グリシン置換体は最も高い転移活性を、セリン置換体は最も低い転移活性を示した。また、グライコシンターゼを様々なアクセプター二糖に作用させたところ、β-1,6-グルコシド結合を含むオリゴ糖が合成された。
精製したHhGH30Aを4 ℃で長期間保存すると、N末端側が切断される現象が観察されたため、質量分析により切断部位を推定した。しかし、N末端領域をトランケートした組換えタンパク質を大腸菌で発現したところ、不溶化したため、結晶化に使用するのは難しいと判断した。一方、精製HhGH30AにEDTAを加えると、長期保存中でもタンパク質の分解が観察されなかった。数種類のスクリーニングキットを用いて実験を行った結果、一つの条件で結晶が得られた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
縮合反応による新規糖質の合成、グライコシンターゼを用いた糖質合成、固定化酵素を用いた効率的な糖質合成装置の作製を達成できているため、おおむね順調に研究が進展していると判断している。
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| Strategy for Future Research Activity |
グライコシターゼを用いた多糖の合成や加工が可能であるか検証する。GH30酵素の結晶の最適な生成条件を探索し、良質な結晶を得ることができた場合はX線構造解析を行う。GH30酵素の触媒残基以外のアミノ酸残基の機能解析にも取り組む。
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| Causes of Carryover |
（理由）新型コロナウイルスの影響で、参加した学会がオンライン開催となったため、出張に要する支出がなかった。年度当初には予定していなかった経費が大学から支給されたため、合算使用により小型恒温振とう培養機を購入する際の科研費負担分を減らすことが可能となった。
（使用計画）薬品・プラスチック器具などの消耗品を購入する。また、学内機器使用料や学会への出張旅費として使用する予定である。新型コロナウイルスの影響で研究活動が制限される場合は、次年度以降の活動のために助成金の使用を抑える可能性がある。
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Research Products
(2 results)
