GH30 β-1,6-グルコシダーゼの構造機能解析と有用糖質合成への応用

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05826
• Research Institution: Mie University
• Principal Investigator: 磯野 直人 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (70378321)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 勝崎 裕隆 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (10262990) ; 三宅 英雄 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (50362364) ; 梅川 碧里 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (60633097)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: GH30 / β-グルコシダーゼ / グライコシンターゼ / ゲンチオビオース

Outline of Annual Research Achievements

Halobacillus halophilus由来のGH30酵素(HhGH30A)の求核触媒残基をグリシンに置換したグライコシンターゼを用いて、ラミナリビオースをアクセプター、α-グルコシルフルオリドをドナーとした反応を行った。生成物をHPLCで精製し、メチル化分析により構造を解析した結果、HhGH30Aのグライコシンターゼはラミナリビオースの非還元末端側と還元末端側のどちらのグルコース残基にもβ-1,6-グルコシド結合でグルコースを転移できるが、特に非還元末端側を好むことが明らかとなった。また、コンブ由来のラミナリン（β-1,3-グルカンを主鎖とする多糖で、部分的にβ-1,6-グルコシド結合の分岐構造が存在）をアクセプターとした反応を行い、メチル化分析により生成物の構造を解析した結果、β-1,6-グルコシド結合による分岐が大幅に増加したことが明らかとなった。このように、HhGH30Aのグライコシンターゼはオリゴ糖だけでなく多糖の加工が可能であることが明らかとなった。
昨年度、HhGH30Aの微小な結晶が得られたスクリーニングキットの沈澱剤組成を参考に、様々な組成の沈澱剤を用いてHhGH30Aの結晶化を試みたが、X線構造解析が可能な結晶は生成しなかった。そこで、HhGH30Aとアミノ酸配列類似度が約50%であるCaldicellulosiruptor bescii由来のGH30酵素の組換えタンパク質(CbGH30_1)を作製し、精製した。CbGH30_1はHhGH30Aと類似した基質特異性を示す酵素であった。スクリーニングキットを使用して実験を行った結果、6種類の沈澱剤を用いた際に良好な結晶が得られた。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

縮合反応による新規糖質の合成、グライコシンターゼを用いた糖質合成、固定化酵素を用いた効率的な糖質合成装置の作製は達成できているが、X線構造解析に使用可能な結晶を得るのに当初の予定よりも多くの時間を要している。

Strategy for Future Research Activity

HhGH30Aのグライコシンターゼと、β-1,3-グルカン伸長酵素であるβ-1,3-グルカンホスホリラーゼの反応を組み合わせて、低分子を基質とした、分岐型のβ-1,3-グルカンの試験管内合成を試みる。また、HhGH30Aのグライコシンターゼを利用して、糖質加水分解酵素の活性測定に役立つ基質の合成にも取り組む。また、当初、解析を計画していたHhGH30Aの代替として、構造や性質が類似しているCbGH30_1の結晶構造解析をすることを検討する。

Causes of Carryover

（理由）現在までの進捗状況が当初予定の計画より若干遅れており、結晶構造解析に至っていないため、解析に必要な経費を使用していない。また、学会では他の研究経費関連の発表を行ったため、出張旅費の支出がなかった。
（使用計画）薬品・プラスチック器具・カラムなどの消耗品を購入する。また、学内機器使用料や学会への出張旅費として使用する 。設備備品の購入は予定していない。