2022 Fiscal Year Research-status Report
GH30 β-1,6-グルコシダーゼの構造機能解析と有用糖質合成への応用
| Project/Area Number |
19K05826
|
|---|
| Research Institution | Mie University |
|---|
Principal Investigator |
磯野 直人 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (70378321)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
勝崎 裕隆 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (10262990)
三宅 英雄 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (50362364)
梅川 碧里 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (60633097)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
|
| Keywords | GH30 / β-グルコシダーゼ / グライコシンターゼ / ゲンチオビオース |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
Caldicellulosiruptor bescii由来β-1,6-グルコシダーゼ(CbGH30_1)の結晶化条件の最適化を行った。また、同条件において、本酵素の生成物であるグルコースとの複合体の結晶化も行った。X線回折装置を用いて各結晶からの回折強度データを測定した。すでに明らかにされているSalmonella typhimurium由来GH30タンパク質SrfJの構造をモデルとした分子置換法により位相決定を行い、分解能約2オングストロームで構造を決定した。CbGH30_1は他のGH30酵素と同様にTIMバレル構造を持つことが明らかとなった。酵素-生成物複合体において、グルコースはサブサイト-1の位置に結合していると予想された。
ラミナリビオース、α-グルコシルフルオリド、α-グルコース 1-リン酸を基質として、HhGH30Aのグライコシンターゼと、Ochromonas danica由来β-1,3-グルカンホスホリラーゼ（β-1,3-グルカン伸長酵素）の反応を同時に行った。その結果、直鎖β-1,3-グルカンの沈殿（α-グルコース 1-リン酸を基質としたβ-1,3-グルカンホスホリラーゼのみの反応で生じる）は生じず、水溶性の多糖が合成された。生成した多糖をエタノール沈澱で回収し、メチル化分析により構造を解析した。その結果、水溶性多糖はβ-1,6-グルコシド結合による分岐を有するβ-1,3-グルカン（β-1,3-1,6-グルカン）であることが明らかとなった。また、この水溶性多糖のグルコース重合度をサイズ排除HPLCで分析したところ、数平均重合度が35、重量平均重合度が56と計算された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
当初、解析を計画していたHhGH30Aでは構造解析のための良好な結晶が得られず、構造や性質が類似しているCbGH30_1の結晶構造解析に方針を変更したため。
|
| Strategy for Future Research Activity |
求核触媒残基あるいは酸塩基触媒残基に変異を導入したCbGH30_1と、基質であるゲンチオビオースの複合体の結晶化および構造解析を試みる。また、さらに高精度な構造解析を行うために放射光施設での分析が可能であるか検討する。また、HhGH30Aのグライコシンターゼを利用して、糖質加水分解酵素の活性測定に役立つ基質の合成を試みる。
|
| Causes of Carryover |
（理由）現在までの進捗状況が当初予定の計画より若干遅れており、結晶構造解析が完了していないため、解析に必要な経費や、成果発表に必要な経費を使用していない。
（使用計画）薬品・プラスチック器具・カラムなどの消耗品を購入する。また、学内機器使用料や学会への出張旅費、専門誌への投稿関連費用として使用する 。設備備品の購入は予定していない。
|
