2023 Fiscal Year Annual Research Report
GH30 β-1,6-グルコシダーゼの構造機能解析と有用糖質合成への応用
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19K05826
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| Research Institution | Mie University |
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Principal Investigator |
磯野 直人 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (70378321)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
勝崎 裕隆 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (10262990)
三宅 英雄 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (50362364)
梅川 碧里 三重大学, 生物資源学研究科, 准教授 (60633097)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2024-03-31
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| Keywords | GH30 / β-グルコシダーゼ / β-1,6-グルコシダーゼ / グライコシンターゼ / ゲンチオビオース / 結晶構造 / 縮合反応 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Caldicellulosiruptor bescii由来β-1,6-グルコシダーゼ(CbGH30_1)の触媒残基変異体とゲンチオビオースの複合体の結晶の生成を試みたが、良質な結晶は得られなかった。また、野生型酵素とゲンチオビオースの複合体結晶の作製を試みたところ、サブサイト-1の位置にのみグルコースが結合した結晶が得られた。
Halobacillus halophilus由来のGH30酵素(HhGH30A)を用いた縮合反応によりヘテロ二糖やヘテロ三糖の合成を行い、HPLCで生成物を分取した後、NMRとESI-MSで構造を解析した。グルコースとフルクトースを基質とした反応を行ったところ、β-D-グルコピラノシル-β-D-フルクトフラノースが得られた。また、グルコースとスクロースを基質とした反応を行ったところ、β-D-グルコピラノシル-(1→6)-α-D-グルコピラノシル-(1→2)-β-D-フルクトフラノシドとα-D-グルコピラノシル-(1→2)-[β-D-グルコピラノシル-(1→6)-]β-D-フルクトフラノシドが得られた。
HhGH30Aの求核触媒残基をグリシンに置換したグライコシンターゼを用いて、p-ニトロフェニルβ-グルコシドをアクセプター、α-グルコシルフルオリドをドナーとした反応を行った。生成物をToyopearl HW-40Sで精製し，NMRとESI-MSで構造解析を行ったところ，pNP-β-ゲンチオビオシドと同定された。この配糖体はβ-1,6-グルカナーゼの簡便な活性測定に有用であることが明らかとなった。
また、組換え型β-1,6-グルコシダーゼの生産に関連して、自動誘導培地を使用したコールドショック発現系において、IPTGを添加することなく可溶性酵素を発現できることを確かめた。
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