新規調節因子の同定によるイネ種子の休眠・発芽調節機構の解析

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05830
• Research Institution: Kyoto Prefectural University
• Principal Investigator: 森田 重人 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (20295637)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 北島 佐紀人 京都工芸繊維大学, 応用生物学系, 准教授 (70283653)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 種子 / 発芽 / 休眠 / レドックス調節 / イネ

Outline of Annual Research Achievements

植物の種子休眠と発芽は、穀類種子の穂発芽や作物の生育に影響することから、農業上重要な問題であるが、主要穀物であるイネではその調節機構について不明な点が多い。本研究ではイネ種子の休眠・発芽の調節機構の解明を目的として、令和2年度には以下の実験を行った。
1) OsGRXC2;2の標的タンパク質の探索：本研究では、イネ種子において発芽抑制に働いているタンパク質であるグルタレドキシンOsGRXC2;2について、その標的タンパク質をプロテオーム解析により同定することを目指している。今年度は、OsGRXC2;2過剰発現系統、およびコントロール系統の種子で、発現レベルや酸化還元状態の異なるタンパク質を検出するため、種子タンパク質の２次元電気泳動を行った。完熟種子から調製した可溶性タンパク質を分画した結果、過剰発現系統とコントロール系統で発現の異なるタンパク質スポットが検出された。
2) 新規休眠性変異体の遺伝解析：本研究では、種子の休眠性が上昇した新規変異体系統（N41系統）を解析している。この系統は、形質転換体作製の際の培養変異によって生じた変異体であると考えられ、原因遺伝子の同定を目的として遺伝解析を進めている。令和元年度にN41系統のT2世代23個体の中から、顕著に休眠性の上昇した個体を選抜した。令和2年度はその後代（T3世代）46個体を栽培し、得られた種子を用いて休眠性を調査した結果、予想に反して全ての個体で休眠性の上昇は見られなかった。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

OsGRXC2;2標的タンパク質の探索については、共免疫沈降による相互作用タンパク質の検出を計画していたが、共免疫沈降が出来ておらず計画よりもやや遅れている。また休眠性変異体N41系統の遺伝解析については、予想外の結果となったため当初の計画を変更せざるを得ない状況となった。

Strategy for Future Research Activity

1) OsGRXC2;2の標的タンパク質の探索：未実施である抗OsGRXC2;2抗体を用いたイネ種子タンパク質の共免疫沈降について、結合・溶出条件の検討を行い、相互作用タンパク質の捕捉を試みる。沈降画分に含まれるタンパク質量は少ないと予想されるため、当初計画していた２次元電気泳動ではなく、通常のSDS-PAGEで分画する。また並行して、OsGRXC2;2過剰発現系統、発現抑制系統、コントロール系統の登熟種子タンパク質を２次元電気泳動で分画し、各系統間で発現に差の見られるタンパク質を検出する。これらのタンパク質のバンド・スポットを切り出し、質量分析によりタンパク質の同定を行う。
2) 新規休眠性変異体の遺伝解析：T2世代で休眠性の上昇が見られた個体の後代において、休眠性が上昇していなかったことから、表現型が安定しないことが明らかとなった。そのため当初計画していた遺伝解析による休眠性変異体系統の確立は難しいと判断し、方針を変更することとした。今後、再度N41系統のT2世代において休眠性の上昇した個体を複数選抜する。これらの個体から登熟種子を採取し、RNA-seq解析により共通な発現変動を示す遺伝子を明らかにし、休眠性関連遺伝子として同定する。

Causes of Carryover

理由）　研究が当初計画に比べやや遅れており未実施の実験があるため、試薬・器具などの物品費が予定を下回る金額となった。

使用計画）　計画よりも遅れている実験については次年度に実施するため、それに伴う試薬・器具の購入に当てる予定である。