イネXIPによる病原菌抵抗機構の分子基盤の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05834
• Research Institution: Kindai University
• Principal Investigator: 大沼 貴之 近畿大学, 農学部, 准教授 (60446482)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 阻害タンパク質 / キシラナーゼ / 植物病原菌 / イネ

Outline of Annual Research Achievements

イネの発現するキシラナーゼ阻害タンパク質XIP（Xylanase Inhibitor Protein）による病原菌感染に対する抵抗機構の分子基盤を解明するために、複数種のイネXIPと、イネ立枯れ病菌が感染時分泌するキシナラーゼRXyn1およびRXyn2の組換え型タンパク質の発現を行った。RXyn1とRXyn2はそれぞれ糖質加水分解酵素（Glycoside Hydrolase）ファミリーGH10および11に分類される。今年度、発現系が既に構築されているOsXIPとriceXIPに加え、新たにOsHI-XIPとOsChib3H-gの発現系構築に成功し、安定的に4種のXIPの生産が可能となった。RIXIについては引き続き発現ベクター/宿主株の検討を行っている。人工基質であるpNP-Xylobiosideを基質に用いて、新たに得られた2種のXIPのRXyn1およびRXyn2に対する阻害活性評価を行い、各XIPの阻害活性の特異性とIC50値を決定した。また、ゲルろ過クロマトグラフィーにより、2種のXIPとRXyn1およびRXyn2の複合体形成能を調べた。その結果、OsHI-XIPはRXyn1およびRXyn2と安定的な二量体を形成するだけでなく、安定的な３量体を形成することが示唆された。4種のXIPの立体構造を決定するために、蒸気拡散法による結晶化を行った。また、複合体形成が確認されたタンパク質のペアについては、共結晶化を行った。その結果、OsXIP、riceXIPおよびOsHI-XIPについては結晶を得た。また、幾つかの条件下で複合体の結晶も得ることができた。現在X線結晶構造解析による各立体構造の決定を進めている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

イネXIPの一つであるRIXIの発現系構築が上手くいっていないものの、他の4種については発現、精製、阻害活性評価および結晶化まで進行している。また、幾つかの結晶については良質な回折像を得ており、立体構造決定までスムースに至ることが予想されることから、本研究はおおむね順調に進行している。研究計画ではITC（等温滴定型熱量計）を用いて、XIP－キシラナーゼ間の相互作用解析を行うことを計画していたが、幾つかの組み合わせの実験において、相互作用に伴う発熱もしくは吸熱が微弱であったことから、結合定数および結合における熱力学的パラメーターの決定には至っていない。

Strategy for Future Research Activity

結晶が得られているタンパク質については、順次X線による立体構造解析を進める。結晶が得られていないタンパク質もしくは良質な回折像が得られない結晶については、結晶化条件を変更し、オイルバッチ法やゼオライトを用いた結晶化法も採用しつつ、再スクリーニングを行う。ITCによる結合実験において、熱の出入りが微弱なため相互作用解析ができなかったXIP－キシラナーゼの組み合わせが存在したことから、両分子間の結合性については、ゲルろ過クロマトグラフィーおよび超遠心分析法により評価するよう、計画している。

Causes of Carryover

新型コロナウィルスの感染拡大により、参加予定学会がオンライン開催になったために旅費の支出が減少した。また、非常事態宣言等による外出自粛のため実験を担当する予定であった学生の出校が困難となる時期があり、物品費の支出が減少した。研究が遅延しないようアルバイトを採用したため、人件費の支出が発生した。次年度については感染状況に影響を受けることが予測されることから、今年度と同様にアルバイトによる研究遂行のため予算を執行する予定である。