2020 Fiscal Year Research-status Report
糸状菌が生産する酸無水物多量体の構造多様性創出に関する研究
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19K05836
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
尾崎 太郎 北海道大学, 理学研究院, 助教 (40709060)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 生合成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究課題では、糸状菌が生産する二次代謝産物のうち、無水マレイン酸型モノマーが多量化した化合物群に焦点をあて、一連の化合物の構造多様化機構の解明を目的として研究を行っている。具体的には、①骨格構造の異なる酸無水物多量体ゾフィエリン (ZFL) /ホモイドライド (PMD) /コーディアンハイドライド (CAD) 生合成遺伝子の系統的機能解析と②多量化の反応点・反応様式の制御機構の解明に取り組む。今年度は、PMDとCADの生合成遺伝子について解析した。
PMDの生合成については、前年度に構築した無水マレイン酸型モノマーを生産する麹菌形質転換体を宿主として、生合成経路の再構築を試みた。モノマー生産株に、二量化酵素遺伝子を導入して共発現した結果、新たに化合物1が生産された。形質転換体を大量に培養し、化合物1を単離した。単離した化合物の構造解析により、本化合物が無水マレイン酸型モノマーの二量体であることを明らかにした。化合物1とPMDの炭素骨格が同一であったことから、化合物1はPMDの生合成中間体であると考えられた。
CADの生合成についても、前年度から継続して研究を行った。生産菌の培養液を分析し、二量体CDA-Aと三量体CDA-Bの他に、これらの化合物の構成単位と考えられるモノマーＡ及びモノマーhomo-Aが生産されていることを見出した。また、CADの生合成遺伝子クラスターに存在する二量化酵素遺伝子を導入した麹菌形質転換体を作製し、上記2種のモノマーの微生物変換を試みた。形質転換体の培養液に2種のモノマーを添加し、生成物を分析した結果、上記2種のモノマーを基質としてCAD-A/Bが生合成されることを明らかにした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度は、ZFLの生合成遺伝子の機能解析を行い、二量化酵素の機能解析に成功していた。また、無水マレイン酸型モノマーの二量化によって九員環が形成された後、酸化酵素が触媒する酸化的環縮小反応によって、ZFLの構造を特徴づける八員環骨格が構築されることを明らかにしていた。本年度は、PMD/CADの生合成においてZFLの生合成と類似の二量化酵素遺伝子が、無水マレイン酸型モノマーの多量化に関与することを異種発現により明らかにした。この結果から、当初予想したように類似の生合成酵素によって異なる酸無水物多量体の骨格が構築されることを示すことができたと考えている。これらの結果については、日本農芸会や日本化学会などで発表を行った。また、ZFLやPMDについては、無水マレイン酸型モノマーを生産する形質転換体を構築できていることから、これらの株を宿主として各二量化酵素を発現することで、各生合成酵素の基質特異性やアルキル鎖長の違いが生成物の構造に与える影響を調査することができると期待している。以上のことから、本研究は順調に進展していると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
初年度の研究により、酸無水物多量体型天然物の生合成においては、無水マレイン酸型モノマーの二量化以外に、酸化反応も骨格多様化に重要であることを明らかにした。今年度単離したPMDの生合成中間体1とPMDの構造を比較すると、アルキル鎖の酸化度に違いが見られることから、PMDの生合成においてもZFLと同様の酸化酵素が関与すると考えられる。現在、候補として見出した酸化酵素遺伝子を、二量体を生産する形質転換体に導入して機能解析を進めている。酸化生成物と考えられる化合物が得られていることから、単離と構造解析を行う予定である。また、酸化酵素を組換え蛋白質として調製し、酵素反応を検討する。
CADの生合成については、本化合物に特有のモノマーhomo-Aの生合成について解析を進める。既に機能解析済みであるZFLの生合成酵素との連続反応によりアルキルクエン酸脱水酵素については予備的に活性を検出できており、引き続き条件を検討する。活性が検出できていないアルキルクエン酸合成酵素についても、同様に酵素反応条件を検討する。
これまでにZFL/PMDの前駆体となるモノマー生産株を構築できたことから、これらの株を宿主としてZFL/PMD/CADの生合成に関わる各二量化酵素遺伝子を共発現することで、二量化酵素の基質特異性を検証する。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウイルス感染症の影響により、実験を停止していた期間があることや、参加予定であった学会のオンライン化により旅費が必要となくなったことなどから、次年度使用額が生じた。
次年度は、形質転換体が生産する化合物の構造解析や遺伝子組み換え実験、生合成酵素の生化学解析を進めるため、消耗品の購入に予算を使用する予定である。また、研究成果発表のための旅費、論文の英文校正等に予算を使用する。
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