2019 Fiscal Year Research-status Report
Study for reaction control of multifunctional cytochrome P450 enzyme MycG
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19K05851
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| Research Institution | Toho University |
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Principal Investigator |
安齊 洋次郎 東邦大学, 薬学部, 教授 (20318299)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
福本 敦 東邦大学, 薬学部, 講師 (50516391)
飯坂 洋平 東邦大学, 薬学部, 助教 (40770425)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 多機能型P450 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
2019年度は多機能型P450 酵素MycGが触媒する水酸化、エポキシ化、脱メチル化の３種類の酸化反応に関与するアミノ酸残基の同定を試みた。組換え大腸菌によるMycGの発現系の構築とmycinamicin生合成中間体を用いた微生物変換試験法を確立した。取得した組換え大腸菌はP450のレドックスパートナーであるferredoxin reductaseとferredoxin を同時に発現するため、大腸菌培養菌体を用いた簡易的な微生物変換試験が可能である。MEGAWHOP法によりMycGランダム変異体を発現する組換え大腸菌ライブラリーを構築し、mycinamicin生合成中間体Mycinamicin IVの微生物変換試験を行った結果、最終産物であるMycinamicin IIへの変換率が低下したMycG変異体を11個取得した。MycG変異体として、Mycinamicin IVとMycinamicin IIとの間の生合成中間体であるMycinamicin Vが蓄積した変異体や副産物であるMycinamicin Iの量が増加あるいは減少した変異体が確認されている。現在、各変異体の変異アミノ酸残基の解析を進めている。また、同時に既に取得しているmycG欠損株Micromonospora griseorubida TPMA0025へのMycG変異体遺伝子の導入を進めており、mycinamicin生産への影響を調べている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当初、計画していたMycG結晶構造解析により基質認識の関与が推定されたアミノ酸残基の変異を導入したMycG変異体に関する実験は着手してはいないが、ランダム変異により取得した変異体には興味深い変異体が多く得られており、MycG結晶構造解析のデータとの検証を、現在、進めている。また、本研究は生産株におけるMycG変異体の機能発現の有無が重要であり、2019年度には予定していなかったmycinamicin生産菌でのMycG変異体機能検証を実施出来たことは評価に値する。
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度に取得したMycG変異体の酵素学的評価を行う。2019年度に取得したMycG変異体は１つの変異体について複数の変異が導入されているため、それぞれの変異の検証は組換え大腸菌によるmycinamicin生合成中間体を用いた微生物変換試験のみでは不十分であり、精製酵素を用いた酵素学的な検証を行う。また、mycG欠損株M. griseorubida TPMA0025へのMycG変異体遺伝子の導入株の評価も継続して進める。さらに、変異型MycG-FNR-Fd融合酵素の構築も開始する。
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| Causes of Carryover |
効率的な実験を行ったため、次年度使用額が生じた。この次年度使用額は2020年度の支給額と合わせて試薬などの消耗品の購入を主に有効活用したい。
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