2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of Induced Fit Off/On Type Fluorescent Probes for the Detection of Disease Related Protein
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19K05854
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| Research Institution | Nagahama Institute of Bio-Science and Technology |
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Principal Investigator |
河合 靖 長浜バイオ大学, バイオサイエンス学部, 教授 (20240830)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 蛍光プローブ / 分子イメージング / タンパク質の構造変化 / アミロイドタンパク質 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、アミロイド線維形成など異常な構造変化を伴ったタンパク質蓄積メカニズムの解明を目的とし、構造変化によるoff/onスイッチング機能を有した革新的な蛍光プローブを開発し、これによって、タンパク質の構造変化が検出可能か評価を行うことを目的としている。
令和元年度は、構造変化によって蛍光がoff/onスイッチングできる分子を量子化学計算により設計し、それらを実際に化学合成し、蛍光スペクトル測定によりその機能を確認した。基本骨格としては蛍光色素部位であるプテリン環と電子アクセプター部位であるフェニル基を柔軟なリンカーで連結させた構造を有する。これは蛍光部位とアクセプター部位が接近した時に光誘起電子移動(PET)機構によって消光し、乖離した時には距離の増大による電子移動速度の低下により発光するという設計である。そしてフェニル基にはアクセプターとして必要なニトロ基の様な電子求引基を導入する。量子化学計算において密度汎関数法を用い、接近型のモデル化合物としてリンカーを介さずに蛍光部位とアクセプター部位が直接連結した種々の化合物を用いて理論計算を行った。それぞれの化合物の最適化構造に関する分子軌道及び励起エネルギーを計算し、接近型で蛍光がoff状態になることが確認された化合物に対し、エチレングリコール鎖をリンカーとした目的化合物を設計した。そして目的の蛍光プローブとして4種類の構造の異なる化合物を実際に合成した。
合成した化合物は全て吸収スペクトル及び蛍光スペクトルを測定し、複数の化合物において蛍光部位とアクセプター部位の接近／乖離によるoff/on型蛍光プローブとして利用できることを確認した。これにより構造変化によって蛍光のoff/onがスイッチングできる新規な蛍光プローブの開発に成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
密度汎関数を用いた量子化学計算を駆使する事で、目的とする蛍光プローブの接近型での最適化構造に関する分子軌道及び励起エネルギーを計算し、構造変化による蛍光のoff/on状態が変化可能な化合物を数多く見出した。この理論化学による分子設計を経て、そこで見出された候補化合物の中から実際に多くの化合物を合成する事にも成功し、さらに蛍光スペクトルを含む各種スペクトルの測定により、合成された化合物群が蛍光部位とアクセプター部位の接近／乖離によるoff/on型蛍光プローブとして利用できることを確認した。以上の事から、概ね当該年度の目標は達成できていると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和2年度も当初の計画通りに進める。まず、前年度に合成した幾つかの蛍光プローブが、構造変化によってoff/onスイッチングできるかどうかを評価する。水溶液中でプテリン環部位とフェニル基部位の疎水性相互作用による接近構造での蛍光消光評価を行い、更に長鎖アルコール等で溶媒の疎水性を段階的に増大させたり、シクロデキストリンを加えてホストゲスト相互作用により開いた状態を誘導して蛍光評価を行う。これらの系により、合成したプローブが構造変化での接近／乖離による蛍光のoff/onスイッチングが可能かどうかを評価する。また、加熱処理などで構造変化することが良く知られている、牛血清アルブミン(BSA)などのタンパク質を用いて、タンパク質の構造変化を蛍光のoff/onスイッチングで検出可能かどうかを評価する。
令和3年度は、前年度に評価して接近／乖離による蛍光のoff/onスイッチングが可能であった蛍光プローブを選択し、実際にアミロイドβ凝集体が蛍光検出可能かどうかを評価する。また、アミロイドβ以外の疾病関連タンパク質の構造変化やミスフォールディングが検出可能かどうかについても検討する予定である。更に、プテリン結合型葉酸関連酵素の競合阻害活性評価を行い、蛍光のoff/onによる阻害活性のハイスループットスクリーニングが可能かどうかを測定し、この新しい蛍光プローブが抗がん剤や抗生物質の評価にも利用可能かどうかを評価する。
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| Causes of Carryover |
研究の計画段階では、新規化合物である蛍光プローブの合成方法を確立するために試行錯誤が予想された。また、なるべく多くの化合物を合成する必要があった。そのために合成関連試薬を多く予定していたが、実際には本研究経費により設備備品として導入した自動有機合成装置により効率的に合成する事ができ、予定より少ない予算で研究計画が達成できたため。
繰り越した助成金は、前年度に合成したプローブを用いてより多くのタンパク質を購入して研究を実施するために使用する予定である。
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Research Products
(4 results)
