Creation and search of new fat-soluble vitamins

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05888
• Research Institution: National Agriculture and Food Research Organization
• Principal Investigator: 小竹 英一 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品研究部門, 上級研究員 (20547236)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 今場 司朗 国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 食品研究部門, 上級研究員 (20332273)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ビタミン / 有機合成 / 腸管吸収 / 代謝変換 / フレイル / ロコモーティブシンドローム

Outline of Annual Research Achievements

ビタミンD（VD）は当初は抗クル病の脂溶性ビタミンとして発見されたが、現在では様々な疾病（癌、糖尿病、感染症、うつ病等）予防にも関与していることがわかってきている。日光浴により皮膚でVD3が生合成可能であるが地理的要因によっては困難な上に、日光には皮膚癌、白内障等のリスクがある。VDは食品から摂取可能であるが、魚介類、鶏卵、キノコ等と限定され、摂取不足になりやすい。VD欠乏は自覚症状が乏しく、高齢者では骨折等からロコモ、要介護の要因となるが、介護に至る前のフレイルを予防することが重要である。
このような問題に対して、申請者はVD摂取機会の増加を目的として、VD4-7についての生体利用性に関する研究を行ってきた。これらのうちVD4以外は市販品が無いため、ステロールを出発物質として有機合成しなければならない。また、申請者が有する脂溶性成分に対する吸収促進法を適用することで少ない摂取機会での効率的な吸収についても検討を行ってきた。
VD5-7の合成過程で、新規VDの創製を思い至り、2019年度は出発物質から有機合成をはじめた。出発物質の入手が困難であった。構造決定に供するには最終的な合成反応物の純品数mg得る必要があり、出発物質1ｇは必要であるが、その量を市販品で入手できない可能性もある。天然から得るには、天然物と有機溶媒が大量に必要、分離操作も必要で、時間と労力もかかる。こちらの手法の文献調査をしつつ、試薬を扱う代理店をあたった。その結果、かなり高額であるが市販品を購入できた。
過去同様の手法で有機合成、精製、構造決定を行い、新規VDを２つ得た。VDが何らかの機能（性）を発揮するには活性化体へと代謝変換するか、有機合成する必要がある。まずは計算化学的手法により活性化体の機能性を評価した。現在、これら新規物質の物質特許出願に向けて、特許事務所と一緒に明細書を準備中である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

下記４点について並行して検討中である。特許の申請準備に所内手続きは順調なものの、時間がかかってしまった結果、進捗は遅れ気味と考える。
１、新規VD合成：出発物質を入手、有機合成、精製、構造決定を行った。２つの新規物質が得られた。これらの有用性についてはVD体のままでは不活性であるため検討できない。活性化体への変換を行うのは量的に困難である。そこで計算化学により代謝変換産物についてシミュレーションを行った。その結果、既存のVDよりもカルシウム吸収性に関しては活性が低いと見積もられた。ただし、摂取機会を増やすという目的は達成が可能であろう（天然の存在は今後の検討課題）。一方で、抗癌作用については高い活性も見積もられた。文献調査と合わせて次のことを考えた。活性化VD3は活性が高過ぎて石灰化の副作用がある。副作用の低いVDの開発が検討されており、同様の考えで新規VDは副作用の低い制癌剤の開発につながる可能性がある。現在、特許事務所協力下、9月30日頃までの出願に向けて明細書を準備中である。
２、吸収促進メカニズム：脂溶性成分は消化管で胆汁ミセルに可溶化されて吸収される。申請者はカロテノイドの腸管吸収研究を行っており、極性脂質が吸収促進する現象と機構について報告してきた。機構についてはカロテノイド以外の脂溶性成分にも適用できそうである。そこでこの吸収促進技術をVDへ応用し、少ない摂取機会で効率的な吸収を目指す。促進機構には細胞間結合の関与まで明らかにしていたが、2019年度は細胞内コレステロールを直接定量し、その関与を確認した。VD2-7については吸収促進を確認済みであるが、新規VDについては未検討である。
３、ゲノム編集細胞：脂溶性成分の腸管吸収に関与する因子のノックアウト（KO）細胞を樹立中である。
４、代謝変換：培養細胞を使って代謝変換を検討中である。

Strategy for Future Research Activity

下記４点について並行して推進する。特許出願継続の他、依頼講演を予定（コロナで延期）。
１、腸管吸収：新規VDについて、腸管モデル細胞Caco-2を用いて吸収を調べる。VDの混合ミセルを調製し、細胞への取込量を定量する。既知のVD2-7と取込量を比較する。
２、ゲノム編集細胞：脂溶性成分の腸管吸収は、単純拡散と促進拡散の両方が関与していると考えている。VDについても同様の促進因子が関与していることが想像できる。過去、その因子に対する阻害剤やsiRNAを検討したが、より直接的な関与を調べるためゲノム編集でノックアウト（KO）した細胞を作製した。Caco-2を親株として、KO細胞、対照細胞までは得ている。KO細胞は４クローン得ているが、ウエスタンブロットでKOを確認する。加えて、遺伝子レベルでも確認する。こちらはプライマーの設計から行う。
３、代謝変換：VDは体内に吸収されたのち、肝臓で１段回目の、腎臓などで2段回目の活性化を受けたものが活性を示す。新規VDの代謝を確認するための実験系を構築する。合成して得た量が少ないため、実験は少量スケールに限定される。そこで、トランスウェルのapical側に肝臓の、besal側に腎臓の培養細胞を使い、VDを添加して代謝産物が生成できるのか調べる。VDは申請者が有する液中乾燥法の技術を使って培地中に添加することで均一性と添加濃度を制御できる。既知のVDで代謝を確認できるような実験系が確立できた後、新規VDで行う。
４、天然の存在確認：新規VDは天然に存在している可能性がある。その検索研究を行っていく。過去の文献から出発物質が存在する場所に前駆体が存在する可能性が高いことがわかる。食品の観点からのVD体の研究だけではなく、活性化体については副作用の少ない抗癌剤としての潜在力も秘めているので、活性化体を大量合成できれば薬品として使える可能性もある。

Causes of Carryover

今年度使用額は、研究費を効率的に使用して発生した残額である。
次年度に請求する研究費と合わせて研究計画遂行のために使用する。