2021 Fiscal Year Research-status Report
リン脂質（レシチン）の改変・加工に用いる新規耐熱性ホスホリパーゼの性質と応用
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19K05898
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| Research Institution | Kyoto Prefectural University |
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Principal Investigator |
辻本 善之 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 講師 (20315930)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | ホスホリパーゼ / ミセル / リポソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ホスホリパーゼ(PL)は細胞膜成分であるリン脂質を分解するために、大腸菌などを用いた異種発現による大量調製が一般的に困難である。しかし、本研究において好熱性細菌Caenibacillus caldisaponilyticus B157T株由来のホスホリパーゼA（PlaA）を、酵素活性のないプロ体として大腸菌で発現させた後、市販プロテアーゼを用いたin vitroプロセシングを行うことにより、活性型（成熟型）を得ることに成功した。
PL活性は、基質として卵黄 phosphatidylcholine (PC)、界面活性剤としてタウロコール酸ナトリウムを用い、 pH 7、60℃、20 minの条件で反応を行い、生成した遊離脂肪酸を定量することで評価した。本酵素は、pH 2-12の広範囲で安定であり、pH 6-11で高い活性を示し、60℃まで安定で高い活性を示した。また、種々の界面活性剤・乳化剤を用いて活性測定を行った結果、本酵素は、溶液中に遊離した基質をほとんど認識せずに、ミセルやリポソーム中の基質を認識することが示唆された。金属イオンや阻害剤などの影響実験では、金属キレート剤で活性は阻害されなかったが、 Mg2+、Mn2+、Ca2+存在下では活性が有意に上昇した。また、数種のリパーゼ阻害剤の影響を調査した結果、Ser修飾剤の一つである methyl arachidonyl fluorophosphonateの添加で活性が有意に低下した。また、部位特異的変異導入法を行うことによって、触媒残基Serを特定した。さらに、炭素鎖長の異なるp-nitro phenyl esterを用い、その分解活性を比較した。60℃で、pH 7.0で酵素活性測定を行った結果、炭素数10のpNP-デカン酸に最も高い活性を示した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
コロナによる登校自粛もあり、研究時間が想定より少なかったのが主原因である。
好熱性細菌 B157T株由来のホスホリパーゼA（PlaA）の組み替え酵素の大量調製・精製の方法を確立し、本酵素の性質を明らかにしてきた。しかし、得られた結果の再現性を確認する中で、「研究実績の概要」で記載した酵素の安定性や基質特異性などに大きな差異はないが、精製標品の比活性がややばらつくことが分かった。そのばらつきの原因を種々検討した結果、本酵素の疎水性が高く、カラムや樹脂などへの非特異吸着することと通常のSDS-PAGEでは確認できないことが分かった。
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| Strategy for Future Research Activity |
当該酵素の調製・精製方法や純度の確認方法の見直しを行った結果、安定して高活性の酵素標品を得ることや精製の純度を電気泳動で確認することに成功している。そこで、まず、「研究実績の概要」に記載した内容について、それらの再現性を確認する。さらには、本酵素を利用したリン脂質改変についても詳細に反応条件などを検討していきたいと考えている。
本研究を通して、新規ホスホリパーゼの特徴を明らかにするとともに、環境負荷の少ない酵素を用いたリン脂質の改変方法や機能性脂質の高効率的生産法を確立を目指す。
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| Causes of Carryover |
コロナによる登校自粛などにより十分な実験時間が確保できず、研究を計画通りに遂行することができなかった。従って、試薬購入などが想定より少なかった。
これまでに、明らかにした研究結果の再現性を確認するとともに、予備実験レベルで成功しているリン脂質改変についても反応の最適条件の検討を行う予定である。
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