2020 Fiscal Year Research-status Report
Stimulation of suppressing effects of muscle atrophy by citrulline
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19K05909
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| Research Institution | Iwate University |
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Principal Investigator |
長澤 孝志 岩手大学, 農学部, 嘱託教授 (80189117)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | シトルリン / ロイシン / オートファジー / ユビキチン・プロテアソーム系 / 骨格筋 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
高齢化社会において、持続性のある社会を築くためには健康寿命の延伸が重要である。健康寿命延伸の妨げになるのが骨格筋の萎縮によるフレイル、ロコモティブシンドロームである。今までの研究により、アミノ酸のロイシンに骨格筋タンパク質の萎縮抑制作用があることが明らかになっている。さらに私たちはリジンなどにも同様の作用があることを示した。
シトルリンはタンパク質合成に用いられない、尿素回路の重要なt代謝中間体であるが、このアミノ酸にも骨格筋タンパク質の分解を抑制する作用があることを見出している。シトルリンの作用機構の解析のため、ラット後肢筋から採取した長指伸筋（II型）とヒラメ筋（I型）を用いたex vivoの方法を開発した。本年度はまずこの方法の有効性の確認のため、骨格筋タンパク質合成促進、分解抑制作用のあるロイシンを用いた検討を行った。その結果、ロイシンはAktやmTORのリン酸化を促進し、骨格筋タンパク質の合成を促進、分解を抑制することがex vivoでも示され、その作用はII型である長指伸筋で強いことが明らかになった。
シトルリンについてもロイシンと同様にex vivoで評価した。10mMシトルリンを含むKRB緩衝液で長指伸筋あるいはヒラメ筋をインキュベーションした。Aktのリン酸化は長指伸筋、ヒラメ筋ともに無添加と差はなかった。4E-BP1のリン酸化も無添加と差はなかった。LC3II/Iの値は長指伸筋でインキュベーション1.5時間後にシトルリンによる低下傾向が認められた。ユビキチン・プロテアソーム系の律速であるE3であるAtrogin-1とMuRF1の発現もシトルリンによる抑制はなかった。これらから、シトルリン単独の骨格筋タンパク質分解抑制作用は強くない可能性が示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はex vivoの方法によるシトルリンの作用について研究を実施した。シトルリンの実験に先立ち、ex vivoの方法による評価の確認のため、ロイシンを用いて検討を行ない、本法の有用性、すなわちI型骨格筋とII型骨格筋のアミノ酸によるレスポンスの相違をクリアに評価できることが示された。骨格筋に対するアミノ酸そのものの作用を検討する場合、培養筋細胞を用いることが多い。しかし、培養筋細胞ではI型筋組織とII型筋組織の相違を判断することはできない。Ex vivoの評価はこの点を明確にできる点で優れており、今後、他の食品成分でも応用が可能になったと考える。
シトルリンの作用がI型、II型の筋組織で異なることを期待していたが、実験結果から判断すると、I型、II型どちらの筋組織でもシトルリンにはロイシンのようない強いタンパク質合成促進、分解抑制作用を見出せなかった。これらより、シトルリンの作用はロイシンのようなアミノ酸単独の作用ではなく、シトルリンによる他のアミノ酸、あるいはホルモンによることが考えられた。昨年度の研究において、in vivoでシトルリン投与による一酸化窒素を介した骨格筋タンパク質分解抑制作用は認められないことを示した。また、インスリンの関与も過去の研究で強くない可能性が示唆されていた。したがって、シトルリンの作用は他のアミノ酸が関わることが考えられた。
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| Strategy for Future Research Activity |
本年度のex vivoの方法による検討により、シトルリンの骨格筋タンパク質分解抑制作用はロイシンに比較して弱いことが示された。Ex vivoや培養筋細胞を用いたin vitroの系では、アミノ酸の代謝産物やホルモンの関与を再現することは難しい。一方、昨年度の検討や過去の検討で、シトルリンの重要な代謝産物である一酸化窒素の関与もない可能性が示唆されている。In vivoではシトルリンを投与することで、アルギニンやオルニチンなどの血中濃度の増加が認められている。昨年度のin vivoの検討でもシトルリンとアルギニンの同時投与の有効性が示唆された。したがって、シトルリン以外のアミノ酸の共存がシトルリンの作用に重要なファクターになることが考えられる。
そこで、2021年度はC2C12筋肉細胞を用いて、シトルリン単独ではなくアルギニンなど他のアミノ酸の存在下におけるタンパク質分解の評価を行い、シトルリンと他のアミノ酸の相互作用を明らかにする。具体的には筋管に分化させたC2C12培養筋細胞をシトルリン、あるいはシトルリンにアルギニンなど他のアミノ酸加えた培地で培養し、タンパク質分解に関わる指標をウエスタンブロットを中心に評価する。これらの検討から、シトルリンと他のアミノ酸の相互作用とシトルリンの骨格筋タンパク質分解抑制作用を明らかにする。
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