納豆菌を用いた鶏腸内に生息するカンピロバクター駆逐と腸内フローラへの影響

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05910
• Research Institution: Sugiyama Jogakuen University
• Principal Investigator: 門屋 亨介 椙山女学園大学, 生活科学部, 准教授 (10624942)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: カンピロバクター / 納豆菌 / 枯草菌 / 増殖抑制

Outline of Annual Research Achievements

本研究では、主要な細菌性食中毒の原因であるCampylobacter jejuniをフードチェーン内から撲滅し、食卓に安全な鶏肉を提供することを目的とする。近年注目を集めている納豆菌を用いたヒト腸内フローラ調整、および、病原微生物増殖抑制による原因微生物駆逐の概念を鶏に応用し、鶏腸内から病原微生物を駆逐する。実験室内研究により納豆菌近縁種の枯草菌には多くの病原微生物に対して増殖抑制効果があることが明らかになった。納豆菌を軸にした生菌剤を利用する本研究の最大の利点は、抗生物質利用と比較し多くの病原微生物に対して強い増殖抑制効果をもち、耐性菌の発生もなく、ヒトや動物に対する病原性がない安心・安全な菌である等である。
本年度は、枯草菌をモデルとし実験系の構築を第一の目的とし研究を開始した。これまでの研究基盤からC. jejuniに対し抗菌活性を持たないB. subtilis 168株と抗菌活性の報告がある1512株を用い、検出法、培地、検出法の検討を行った。増殖抑制活性測定には、交差培養法とWell diffusion assay法間での比較を行った。結果、両方法とも増殖抑制効果を目視できるレベルではあったが、Well diffusion assay法がより明確に168株と1515株との違いを明確にした。さらに培地はLB培地より枯草菌最少培地Spizizen Salts培地で培養したときにより強い増殖抑制効果が観察された。
枯草菌を用いた実験モデルが構築できたので、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NBRC）から納豆菌を10株購入し、各株でのC. jejuniに対する増殖抑制効果を測定した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

枯草菌を用いたC. jejuni増殖抑制効果確認実験では、これまでの知見と同様の結果を得ることができた。
続いて、独立行政法人製品評価技術基盤機構（NBRC）から納豆菌10株を購入し、納豆菌での増殖抑制効果を測定した。興味深いことに、Well diffusion assay法では各納豆菌株間で増殖抑制効果にばらつきが存在した。増殖抑制効果が一番高い株はポジティブコントロールである枯草菌1512株より高く、一方、抑制効果が全く無い株もいくつか存在した。この結果の原因を明らかにすることが次年度の課題の一つである。
さらに、納豆菌の増殖抑制効果因子特定のために、培養した培地から菌体を除き凍結乾燥法で濃縮し増殖抑制効果を測定した。その結果、栄養豊富なLB培地より最少培地Spizizen Salts培地培養時に増殖抑制効果が高い株があることが示された。これは培養条件により増殖抑制因子の生産量が変化していることを示唆している。しかしながら、菌株を用いた交差法では抑制効果があったにも関わらず、培地上清では効果がなくなった菌株も存在した。このように各菌株での増殖抑制因子は異なっていることが予想され、その特定が必須である。

Strategy for Future Research Activity

納豆菌を用いたCampylobacter増殖抑制効果試験の運用に関しては、概ね見通しがついた。今後は株式会社タカノフーズから提供される予定の納豆菌1000株を用いてCampylobacterの増殖抑制効果試験を行い、抑制効果が高い菌株の選抜するスクリーニング実験を行う。
スクリーニング実験と並行して増殖抑制因子の特定と生化学的活性測定を行う予定である。培養後の菌体溶液を遠心分離により菌体と培養液を分離し、菌体内タンパク質と分泌タンパク質ないしは分泌化合物のどちらかが増殖抑制効果に寄与しているかを特定する。目的因子の特定には、薄層クロマトグラフィーと分取型HPLCを用いる予定である。
次いで候補納豆菌の腸内フローラへの影響を観察するために、動物実験を行う。増殖抑制効果があった納豆菌を対象動物に与え、腸内の納豆菌の定着と腸内細菌叢の変化を経時的に観察する。同時に体重等を測定し、対象動物の健康状態を観察する。次いで、C. jejuniを投与し、腸内への定着を確認後、納豆菌を投与しC. jejuniの生菌数測定を行う。