2020 Fiscal Year Research-status Report
The effect of flavonoid from the mucosal side in intestinal organoids
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19K05925
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| Research Institution | Yamagata University |
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Principal Investigator |
小酒井 貴晴 山形大学, 地域教育文化学部・理工学研究科, 教授 (70391480)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 腸上皮 / 腸管オルガノイド / Ussing-chamber |
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| Outline of Annual Research Achievements |
腸管のグルコース吸収の大部分を担っているNa+/グルコース共輸送体1(SGLT1)の輸送活性に及ぼすフラボノイドの影響は依然不明なままである。そこで、本申請課題は、1)粘膜側と血液側の仕切り(極性)が維持されている正常細胞のオルガノイド培養系により、生体の生理条件に類似したグルコース 吸収評価系を確立させ、2)各種フラボノイドによるグルコース吸収阻害活性の差異とその作用機序を、Ussing-chamber法(従来法)と比較・検討する。 1）オルガノイド形成効率を増加させないと追加検証実験が難しい状況であったので，培養系の改善を第一に検討した。オルガノイド培養ではDETAキレート法により上皮細胞を単離することが常法であるが，コロニー形成率が高くなかった。そこで，単離処理を5回繰り返して，形成率の高いフラクションを検討した。その結果，フラクション3および4（EDTA処理を3・4回目）の生存性が高く，フラクション3で1.7倍、フラクション4で2.4倍多く含まれていた。さらに，幹細胞マーカーであるLGR5陽性細胞率を細胞免疫化学染色法にて検討した結果，従来法と比較して2.２倍および1.6倍と高値であった。2）グルコース吸収阻害活性の真偽を確認するため，Ussing-chamberによる短絡電流法にてプロアントシアニジンの影響を検討した。その結果，濃度依存的にグルコース誘導性短絡電流値が減少した。マウス空腸部における起電性グルコース輸送を抑制するためのIC50は20.60 microMであった。現在，上記のフラクション3および4によるオルガノイドを形成しており，オルガノイドによる抑制効果を検証する計画である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
正常な単層上皮膜を形成するオルガノイド(球状細胞塊;内側が粘膜側、外側が血液側)の培養系を用いたSGLT1阻害評価系の構築を目指した。オルガノイドを顕微鏡下で微小な吸引用ピペットにて固定した上で、注入用微小ガラスピペットを粘膜側(内部)へ挿入 することを目指した。 吸引用ピペットと注入用微小ガラスピペットは、シングルセルパッチクランプ法で用いる物を試そうとしたが、安定的にオルガノイドを保持することが困難であった。そこで、保持実験を何度も繰り返しできるように，供試オルガノイド数を効率的に増やすことにした。オルガノイド形成は2倍程度に増加させる目処がついた。また、Ussing-chamberによるプロアントシアニジンによる起電性グルコース輸送抑制の50％有効濃度（IC50）は20.60 microMと理解できたので，上記のオルガノイド培養系での検証を急ぎ進める。ただし，今年も新型コロナ感染症対策のための実験環境の使用制限や実験者の移動制限などにより当初計画より遅れてしまった。最終年度では，急ぎ精力的に検討を実施進める計画である。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終3年次のためにまず解決しなければならない課題は，オルガノイド形成効率を上げることに成功したので，その条件で実験を検討することである。オルガノイド保持時にある程度の失敗は諦め，成功したオルガノイドで検証実験を進めるべきだと考えている。検討事項としては，内部へのポリフェノール刺激法であり，酵素反応を利用したグルコース蛍光検出法(市販キット)検討する。管腔側内のポリフェノールや糖の濃度は、非吸収性マーカー(フェノールレッドやポリエチレングリコール)を注入液に混合させておき、補正に用いる。一方で、比較のためのUssing-chamber法でのグルコース吸収阻害効果はすぐに検討できるので、プロアントシアニジン以外のフラボノイドの効果の検討をすすめて，各種フラボノイド分子間の比較が検討できるようにする。
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| Causes of Carryover |
新型コロナ感染症対策のために、実験施設への継続的な入館規制や研究者や学生の移動に制限があったため、どうしても実験停滞のリカバリーもおくれてしまった。このため、オルガノイドの実験系確立に時間がかかってしまい、1年間の全工程50%程度遅れてしまったと感じている。3年次の今年度は、新型コロナ感染症の対策による実験の実施制限の合間をぬって，実験で供試できなかった部分の中で，特に，プロアントシアニジンの効果にターゲットをしぼり，まずは効率的に研究成果が得られるように進める。
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