2020 Fiscal Year Research-status Report
ヒト臓器モデルを用いた分子細胞生物学的手法による機能性食品成分の探索と機能解明
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19K05928
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| Research Institution | The University of Tokyo |
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Principal Investigator |
高橋 裕 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 助教 (30835377)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / 小腸オルガノイド |
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| Outline of Annual Research Achievements |
今年度は，昨年度に引き続き，CRISPR/Cas9システムを用いて遺伝子改変オルガノイドを簡便に作製するための実験技術に関する検討を行った。機能未知な遺伝子のノックアウト（KO）と同時にマーカー遺伝子をノックイン（KI）した際，目的のKI細胞が得られなかったのはトランスフェクション効率の低さに起因すると考え，トランスフェクション方法の検討，さらに採用した方法における条件の最適化を実施した。Venus発現用プラスミドを用いて検討を重ねた結果，最大で50%程度の遺伝子導入効率を達成することができた。さらに最適化したトランスフェクション条件により目的とする遺伝子座にVenus遺伝子のKIを試みたところ，Venus陽性のオルガノイドを得ることができた。このオルガノイドを単離後，拡大培養して標的とした遺伝子の発現量を調べたところ，想定通り，mRNAレベル，タンパク質レベルでKOできていることを確認できた。
また，ヒト小腸オルガノイド由来単層上皮細胞と小腸上皮様に分化させた従来のモデル細胞であるCaco-2細胞における性質の違いについて，遺伝子発現，機能の観点から解析を行った。その結果，ヒト小腸で重要な役割を果たす複数の遺伝子について，Caco-2細胞では発現量が極めて低い一方，ヒト小腸オルガノイドから作製した単層上皮細胞では発現量が高いことを見出した。以上の結果より，ヒト小腸オルガノイドおよびオルガノイド由来単層上皮細胞は，Caco-2細胞よりも生理的応答示す正常なヒト小腸上皮細胞として，様々な研究に有用な生物材料となることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ヒト小腸オルガノイドにおいてゲノム編集技術による遺伝子KOを行う場合，オルガノイドのクローン化は技術的に困難が伴うため，マーカー遺伝子のKIによりポジティブセレクションを行う方法が良いと考え，その方法を検討した。ただし，KI効率は一般的にはKO効率に比べて非常に低く，さらにオルガノイドへの遺伝子導入効率も低いため，KIを達成するためにはトランスフェクション効率を高める必要があると考えた。研究代表者はこれまでにリポフェクション法を用いてオルガノイドに遺伝子導入を行う方法を報告しており，オルガノイドへの一過的遺伝子導入法として複数報告のあるエレクトロポレーションとの比較検討を行った。その結果，リポフェクション法を用いたときのほうが細胞毒性は低いにも関わらず遺伝子導入効率は高く，さらに最適化を行うことで50%程度まで導入効率を高めることができた。この方法を用いて，標的とする遺伝子座にVenus遺伝子をKIしたオルガノイドを得ることに成功した。さらにVenus陽性オルガノイドを単離して解析を行ったところ，想定通り，目的遺伝子がKOされていることを確認できた。
さらにヒト小腸オルガノイドの有用性を検証する目的で，これまでヒト小腸上皮モデルとして汎用されてきたヒト結腸癌由来細胞株であるCaco-2細胞との比較を行った。Caco-2細胞は二次元で，オルガノイドは三次元状態で培養するという違いがあり，培養環境の違いによる差を軽減する目的でオルガノイドを二次元状態で単層培養して比較を行った。その結果，Caco-2細胞では薬物代謝酵素であるCYP3A4の発現誘導が起こらず，さらにグルコースの吸収を司るSGLT1の発現が低いことが指摘されているが，オルガノイド由来単層上皮細胞では薬剤によるCYP3A4誘導が起こること，SGLT1の遺伝子発現量がCaco-2細胞よりも高いことが示された。
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| Strategy for Future Research Activity |
今回，CRISPR/Cas9システムの活用により，標的とする遺伝子がKOされたKIオルガノイドを得ることに成功した。今後は，KIしたオルガノイドの表現型について解析を実施する予定である。また，本方法の汎用性を検証するため，別の遺伝子座に存在する異なる遺伝子に関してもマーカー遺伝子をKIし，ポジティブセレクションによりKO細胞を樹立できるかについても検討を行いたいと考えている。
さらに，ヒト小腸オルガノイドから作製した単層上皮細胞と従来のヒト小腸モデルであるCaco-2細胞を比較した結果，Caco-2細胞において発現量は低いものの小腸で重要な役割を果たすことが知られているいくつかの遺伝子に関して，オルガノイド由来上皮細胞においては高発現することが示された。今後は，遺伝子発現量だけではなく，タンパク質レベルでの活性についても検証を行う予定である。さらに，これまでCaco-2細胞において低いとされる他の生理機能，生理応答に関しても，オルガノイド由来単層上皮細胞との比較を行うことで，オルガノイドがCaco-2細胞よりも生理的で有用なモデルとなるかについて検証を進めていきたい。これらの検討の中で見出された現象の中で，高スループットでの評価が可能と判断できたアッセイに関しては，実際に数千の化合物ライブラリを用いてスクリーニングを実施することを計画している。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍の影響で実験が中断した期間があり，KO細胞の樹立後の表現型解析や遺伝子発現変化に伴う活性変化に対して検証できなかったため，次年度使用額が発生した。これらの検証は次年度に実施する予定である。
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