2020 Fiscal Year Research-status Report
Endolysosomal dynamics involving microautophagy
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19K05950
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
和田 洋 大阪大学, 産業科学研究所, 准教授 (50212329)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ミクロオートファジー / 初期発生 / シグナル伝達 / エンドサイトーシス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
原腸陥入期前後の哺乳類初期胚は、母体からシグナルと栄養を受け取り、胚の組織構築と成長をおこなう。マウス初期胚の場合、母体からの高分子物質の受容には臓側内胚葉とよばれる単層上皮における活発なミクロオートファジーをともなうエンドサイトーシスが中心的な機能をもつ。エンドソームとリソソームの相互作用を担うCORVET分子複合体のサブユニットを欠損するマウス初期胚は、臓側内胚葉におけるエンドサイトーシスが不全となり、原腸陥入以前の発生段階で致死となる。このマウス初期胚の表現型はmTORシグナル、Fgfシグナルなどに異常を示すことを示唆する。これまでの研究から、Fgf経路、Tgf経路,Bmp経路などには顕著な異常を見いだせていない。しかし、mTORシグナルが顕著に低下していることがわかった。そこでmTORシグナルの低下がどのようにして初期発生の異常につながるのかを検討した。
CORVET欠損胚では受精後４ー５日の、着床直後から卵筒胚形成の時期に発生異常が、胚体外外胚葉(ExE)に現れる。この時期は初期発生の「ブラックボックス」とも言われていて実験的に介入するのがむつかしい。そこでCORVET遺伝子にloxP配列を導入したfloxマウスから受精卵を得、栄養芽幹細胞(TS細胞)誘導条件で培養して、ExEの性質を反映する培養細胞を得た。このTS細胞ではExEの分化マーカー、Cdx2が発現している。AdCreの感染によりloxPでの欠失をおこしてCORVET機能をTS細胞から欠損させたところ、Cdx2の発現は変化せず、またEts2やElf5, Tromaなどの分化マーカにも変化が見られない。したがって、CORVET機能欠失と分化マーカーの変動は、培養細胞では再現できなかった。さきにも述べたようにこの時期は解析の難しいところで、困難さを培養細胞で乗り越えようとする試みは成功していない
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
胚盤胞から卵筒胚にいたる発生段階は、初期発生の「ブラックボックス」とも言われ、観察が困難なところであること、したがって、先行研究も限られていること、の理由により、手探り状態で研究を進めている。培養細胞の観察系が初期胚の現象を再現できないことはおおきな痛手であるが、遺伝学的なトリックによって着床以前の胚盤胞で表現型を見いだすことに成功しているので、今後は胚盤胞を中心に観察を進めて、研究成果に結びつける。
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| Strategy for Future Research Activity |
CORVET-LoxPを導入した変異マウスで卵母細胞特異的にCreを発現させ、卵のCORVETを枯渇させる。CORVET+/-父親由来の精子と受精させることで、母親由来のmRNAやタンパク質の寄与をなくした受精卵(maternal KO)を得ることができる。予備的な観察で、maternal KOではE4.5の胚盤胞の段階で表現型が出ており、着床ができないことを見いだしている。今後、この観察系を用いて異常になっている素過程を明らかにしていく。
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| Causes of Carryover |
感染症対策のため研究連絡・研究発表などで旅費を使用することがなくなったため、次年度使用額が生じている。次年度においても、この状況は好転するとはあまり考えていないが、出かける機会の少ない分、実際の実験を進めていく。そのための消耗品などの購入に充当する。
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