2019 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the mechanism underlying osteoclastic differentiation and functional regulation by ligand-independent GPCR activation
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19K05954
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
石橋 宰 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (70293214)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
目良 恒 新潟大学, 医歯学総合病院, 特任講師 (70650381)
乾 隆 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (80352912)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 破骨細胞 / マクロファージ / G蛋白質共役型受容体 / リソソーム / シグナル伝達 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは、リガンド未同定のG蛋白質受容体共役型受容体（GPCR）であるGPR137Bの発現が破骨細胞の分化に伴い顕著に亢進することを見出した。さらに、本遺伝子が欠損した破骨前駆細胞を用いて、GPR137Bが破骨細胞分化に決定的な役割を担うことを明らかにした。この際、リガンド非依存的なGPR137Bの恒常活性が破骨細胞分化に関わることが示唆された。そこで本研究は、破骨細胞分化におけるGPR137Bを介したシグナル伝達の詳細について解析することを目的とする。なお、破骨細胞分化のin vitroモデルとしては、マウスマクロファージ系細胞株であるRAW264を用いた。当該年度は、野生型細胞におけるGPR137Bの過剰発現、およびGPR137B欠損細胞におけるGPR137Bのレスキューを試みた。まず、エピトープ予測ツールにより選定したマウスGPR137Bの部分ペプチドを用いてウサギポリクローナル抗体を作製し、アフィニティー精製を行った。エレクトロポレーションによりマウスGpr137b遺伝子を導入した細胞に対して、この抗体を用いて免疫染色を行った結果、興味深いことに、GPR137Bの局在がリソソーム膜と思われる構造において認められた。一方、一般的にGPCRが局在する細胞膜にはその局在は認められなかった。最近、Ganらにより、リソソームに局在するGPR137BがmTORC1およびその関連分子の局在を制御しているとの報告がなされたが（Nat Cell Biol. 21, 2019)、申請者らの結果はこの報告とよく一致している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
当該年度の目標は、in vitro実験によるGPR137B下流の細胞内シグナル伝達機構の解析であるが、申請者らはRAW264細胞におけるGPR137B過剰発現系の構築に成功し、他の研究者による関連研究の報告とよく一致する知見を得ることができた。一方、GPR137B欠損細胞を用いた実験の結果についてはもう少し精査が必要と思われるが、全体的には、現在の進捗状況は当初計画と比較して概ね順調であると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
GPR137Bが細胞内小器官であるリソソームに局在することは、一般的な細胞膜局在型GPCRと異なり、本タンパク質が細胞外リガンドに依らないシグナリングに関わるという申請者らの作業仮説とよく一致する。今後は、破骨細胞分化におけるmTORC1シグナリングの寄与、および同シグナリングにおけるGPR137Bの役割について詳細に解析する。さらに、計画通りにGpr137bノックアウトマウスの作製を行い、GPR137Bの破骨細胞における役割についてin vivo実験により検証する。
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| Causes of Carryover |
（理由）
当該年度の実験に必要な多くの試薬について、キャンペーンやディスカウントセール等により予定より安価に購入できたため。
（使用計画）
作製した抗マウスGPT137B抗体は、抗血清や精製IgGでは非特異的結合が強く使用に耐えないため、抗原ペプチドを用いたアフィニティ精製を要することが明らかになった。申請年度において精製した抗体の残余は少なく、次年度以降新たに精製を行う必要がある。したがって、新たにペプチドの合成や精製カラムの購入が必要となり、繰越額はこれらの経費として充当する。
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Research Products
(1 results)
