Elucidation of the mechanism underlying osteoclastic differentiation and functional regulation by ligand-independent GPCR activation

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05954
• Research Institution: Osaka Prefecture University
• Principal Investigator: 石橋 宰 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (70293214)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 目良 恒 新潟大学, 医歯学総合病院, 特任講師 (70650381) ; 乾 隆 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (80352912)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: 破骨細胞 / マクロファージ / G蛋白質共役型受容体 / リソソーム / シグナル伝達

Outline of Annual Research Achievements

申請者らは、リガンド未同定のG蛋白質受容体共役型受容体（GPCR）であるGPR137Bの発現が破骨細胞の分化に伴い顕著に亢進することを見出した。さらに、本遺伝子が欠損した破骨前駆細胞を用いて、GPR137Bが破骨細胞分化に決定的な役割を担うことを明らかにした。この際、リガンド非依存的なGPR137Bの恒常活性が破骨細胞分化に関わることが示唆された。そこで本研究は、破骨細胞分化におけるGPR137Bを介したシグナル伝達の詳細について解析することを目的とする。なお、破骨細胞分化のin vitroモデルとしては、マウスマクロファージ系細胞株であるRAW264を用いた。当該年度は、野生型細胞におけるGPR137Bの過剰発現、およびGPR137B欠損細胞におけるGPR137Bのレスキューを試みた。まず、エピトープ予測ツールにより選定したマウスGPR137Bの部分ペプチドを用いてウサギポリクローナル抗体を作製し、アフィニティー精製を行った。エレクトロポレーションによりマウスGpr137b遺伝子を導入した細胞に対して、この抗体を用いて免疫染色を行った結果、興味深いことにGPR137Bの局在がリソソーム膜と思われる構造において認められた。一方、一般的にGPCRが局在する細胞膜にはその局在は認められなかった。最近、Ganらにより、リソソームに局在するGPR137BがmTORC1およびその関連分子の局在を制御しているとの報告がなされたが（Nat Cell Biol.21, 2019)、申請者らの結果はこの報告とよく一致している。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

オーファンG蛋白質共役型受容体Gpr137bは、細胞モデルを用いた先行研究により破骨細胞の分化およびマクロファージのM2極性化に関わることが示された。そこで、本遺伝子のin vivoでの機能を解明するため、Gpr137b遺伝子欠損マウスの作出を試みた。なお、当初の計画では、本マウスの作製を大阪大学大学院医学系研究科附属共同研ゲノム編集センターと共同で行うことになっていたが、同センター担当者の異動等諸般の理由により、作製依頼先を筑波大学トランスボーダー医学研究センターに変更した。
C57BL/6マウス第13染色体qA1領域に存在するGpr137b遺伝子をゲノム編集によりマウス受精卵で欠失させ、7月28日にF0マウスが出生した。これらの中から3系統のF0マウスを選択し、大阪府立大学動物実験委員会による動物実験計画の承認を得た後、同大学動物実験施設に移送した。その後、当該F0マウスと野生型C57BL/6マウスの交配によりF1マウスを作出し、ジェノタイピングを経て、Gpr137b遺伝子ヘテロ欠損マウス同士を交配させた。この結果得られたGpr137b遺伝子ホモ欠損マウスと野生型マウスについて、現在骨形態解析を行っている。

Strategy for Future Research Activity

申請時研究計画に従い、引き続きGPR137Bホモ欠損マウスの骨組織形態の解析を行うと同時に、同マウスから得られる骨髄細胞を用いて、破骨細胞分化能に関する評価を行う。この際、前年度に調整したGpr137b発現用レンチウィルスベクターを用いて遺伝子欠損レスキュー実験を行い、表現型の回復について検討する。また、マウスの細胞や個体を用いて得られたGPR137Bに関する知見が、ヒトにおいても同様に得られるか否かを調べるため、siRNAを用いた遺伝子ノックダウンにより、ヒト破骨細胞前駆細胞を用いた分化誘導実験を行う。

Causes of Carryover

新型コロナウィルス感染拡大防止措置の影響で実質的に研究ができない期間（3月から5月）があったこと、および、これに関連して研究に必要な物品の一部が品薄となり、計画通りに購入できなかったことにより。