2021 Fiscal Year Research-status Report
Elucidation of the mechanism underlying osteoclastic differentiation and functional regulation by ligand-independent GPCR activation
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19K05954
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| Research Institution | Osaka Prefecture University |
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Principal Investigator |
石橋 宰 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 准教授 (70293214)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
目良 恒 新潟大学, 医歯学総合病院, 特任講師 (70650381)
乾 隆 大阪府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (80352912)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | 破骨細胞 / G蛋白質共役型受容体 / レンチウィルスベクター / ノックアウトマウス / 骨形態 / CRISPR/Cas9 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
申請者らは、リガンド未同定のG蛋白質受容体共役型受容体（GPCR）であるGPR137Bの発現が破骨細胞の分化に伴い顕著に亢進することを見出した。さらに、本遺伝子が欠損した破骨前駆細胞を用いて、GPR137Bが破骨細胞分化に決定的な役割を担うことを明らかにした。一方、Ursoら（Bone 127, 104-113, 2019）は、Gpr137b遺伝子の欠損により, マウス骨髄細胞の破骨細胞分化能, およびゼブラフィッシュにおける骨吸収活性が亢進することを報告している。この際、リガンド非依存的なGPR137Bの恒常活性が破骨細胞分化に関わることが示唆された。そこで本研究は、破骨細胞分化におけるGPR137Bを介したシグナル伝達の詳細について解析することを目的とする。
本年度は、
①GPR137Bを過剰発現するRAW264細胞株の作出と破骨細胞分化能の評価、および、②Gpr137b遺伝子欠損マウスの作製と骨形態評価を行った。その結果、①では、Gpr137b過剰発現レンチウィルスベクターを用いて、Gpr137b過剰発現細胞クローンとコントロール細胞クローンをそれぞれ3株ずつ取得することに成功した。そこで、これらの細胞クローンのRANKL依存性破骨細胞分化能について、酒石酸耐性酸フォスファターゼ（TRAP）染色や、各種破骨細胞マーカー遺伝子（カテプシンＫ、TRAP等）の発現解析により評価した。また、②では、筑波大学トランスボーダー医学研究センターとの共同研究にて作製したGpr137b遺伝子欠損マウスについて、骨組織の形態計測および破骨細胞計測を実施した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
①GPR137B過剰発現RAW264細胞株の作出と破骨細胞分化能の評価
Gpr137b発現レンチウイルスベクターを用いて得られたGPR137B過剰発現（OE）株、およびコントロール（CN）株のそれぞれ3株を解析に供した。OE株ではCN株と比較してGPR137Bの顕著な高発現が認められた。また、GPR137Bの局在はリソソームと思われる構造体上に認められた。次に、各細胞株に対し、RANKLによる破骨細胞分化誘導を行った。破骨細胞マーカーである酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ（TRAP)を利用したTRAP 染色を行い、破骨細胞数を計測したところ、OE株ではCN株と比較して破骨細胞数が少ない傾向が認められた。また、破骨細胞マーカー遺伝子の発現量解析の結果、OE株ではCN株と比較してマーカー遺伝子の発現が低い傾向が認められた。以上より、GPR137Bの過剰発現は破骨細胞分化を抑制する可能性が示唆された。
②Gpr137b遺伝子欠損マウスの作出と骨形態評価
CRISPR/Cas9法によりマウスGpr137b遺伝子の第3エクソン領域を欠失させたGpr137b遺伝子ヘテロノックアウト（KO）型マウス（F1ヘテロマウス）を得た。さらにこれらを交配させることにより野生型マウス, およびホモKO型マウスを産出した。これまでに産出したマウスの遺伝子型ごとの匹数は概ねメンデルの法則に従うことから、Gpr137b遺伝子欠損は胎生致死ではないと判断された。次に、幼若マウスを用いて透明骨格標本を作製した後、 標本から大腿骨を分離し、骨長を計測した。しかし、骨格標本においてGpr137b遺伝子の欠損による影響は認められなかった。そこで、大腿骨のパラフィン包埋組織切片を作製し、大腿骨遠位骨端の海綿骨を中心に破骨細胞数計測と形態評価を試みた。しかし、ホモKO型と野生型との間に見かけ上の差異は認められなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
In vitroでは、GPR137Bの過剰発現により破骨細胞分化が抑制される傾向が認められた。しかし、抑制の程度は株により大きく異なるため、統計学的な有意差は認められなかった。そこで、今後、取得する細胞株を追加し、また実験の方法や手技も検証し、さらなる解析を行う必要がある。また、Gpr137b遺伝子欠損マウスの骨髄細胞における破骨細胞分化誘導実験において、今回構築した過剰発現系を用いたレスキュー実験を併せて行う必要がある。さらに、GPR137Bの破骨細胞分化抑制機構は未解明であることから、Gpr137b遺伝子欠損マウス、および野生型マウスの骨髄細胞において破骨細胞分化誘導前後の遺伝子発現変動を網羅的に解析し、GPR137Bが関与するパスウェイを予測することにより、GPR137Bの機能が明らかとなる可能性がある。
一方in vivoでは、Gpr137b遺伝子の欠損による破骨細胞数や骨形態の明らかな変化は認められなかった。そこで、今後はマイクロCT等を用いた詳細な骨形態の計測、骨強度の測定、および血清中や尿中の骨吸収マーカーの定量解析を行う予定である。また、加齢による遺伝子発現量の変化が骨形態に影響を及ぼすことが報告されていることから、今後はより週齢の進んだマウスを用いて同様の実験を行う予定である。
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| Causes of Carryover |
新型コロナウィルス感染拡大防止措置の影響で実質的に研究活動が抑制された期間があり、これに関連して研究に必要な物品の一部が品薄となり、一部の実験が計画通りに進行しなかった。そこで、本研究課題の研究期間は当初の予定では2021年度までであったが、期間延長を申請し、2022年度までの延長が認可されたため、当該実験に係る費用を繰り越すに至った。
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