2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K05955
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| Research Institution | Tohoku Medical and Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
上村 聡志 東北医科薬科大学, 医学部, 講師 (10399975)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 逆行輸送 / アスパラギン結合型糖鎖 / マンナン糖鎖 / 糖転移酵素 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、ゴルジ体で起こる逆行輸送がタンパク質に付加されるアスパラギン結合型糖鎖の成熟過程に関与しているのか、また、その糖鎖構造の変化がタンパク質の寿命（ゴルジ体繋留時間）に関与しているのかを明らかにすることである。標的としているタンパク質は主に逆行輸送の有無でアスパラギン結合型糖鎖の構造が変化する哺乳動物のGM3合成酵素とマンナンという巨大アスパラギン結合型糖鎖を持つ出芽酵母のMIPC合成酵素である。1年目の研究成果は次のとおりである。(1) GM3合成酵素のペプチド抗体を作製し、それが特異的にGM3合成酵素に反応すること、免疫沈降に使用できることを確認した。現在、この抗体を使い、動物細胞に発現させたGM3合成酵素を精製することを試みている。(2) 糖転移酵素の逆行輸送に関わる因子をスクリーニングするために、挿入変異を誘発するウイルスを作製する実験系を構築した。また、GM3合成酵素と相互作用する因子のスクリーニングのため、Yeast-two hybrid membrane システム実験系を構築した。(3) GM3合成酵素の活性を維持した状態で三つのアスパラギン結合型糖鎖をそれぞれ付加させない変異体（単独変異体）を細胞に安定発現させ、その細胞内局在と糖鎖構造を解析した。(4) MIPC合成酵素の逆行輸送シグナルを同定し、それがこれまで知られている逆行輸送経路とは異なる経路で輸送されていることがわかってきた。(5) Csg2というタンパク質が、MIPC合成酵素のマンナン糖鎖構造に影響を与える可能性を示唆するデータが得られた。(6) 哺乳動物で解析するGM3合成酵素以外のタンパク質の候補を探索するために、16種類のパルミトイル化酵素を細胞に安定発現させ、ゴルジ体に安定して局在する酵素を選抜した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
動物細胞を使った研究では、GM3合成酵素のアスパラギン結合型糖鎖の解析、逆行輸送に関与する因子やGM3合成酵素と直接結合する分子をスクリーニングする実験系の準備は整った。さらに、GM3合成酵素以外で解析する候補タンパク質の選定も概ね終了した。また、出芽酵母を使った研究では思った以上に進展が見られた。MIPC合成酵素のゴルジ体繋留に必要な逆行輸送シグナルを同定し、その逆行輸送が既存の経路ではないこともわかってきた。それに加えて、マンナン糖鎖構造に影響を与える可能性のあるタンパク質、Csg2を見いだすことに成功した。ただ、この糖鎖構造変化は当初考えていたMIPC合成酵素の逆行輸送と直接的には関係していないことを示唆するデータも得られている。出芽酵母のゴルジ体におけるマンナン合成がどの程度基質タンパク質の逆行輸送に依存するか、今後さらに解析が必要である。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後、哺乳動物のGM3合成酵素と出芽酵母のMIPC合成酵素のアスパラギン結合型糖鎖の構造解析を実施するために、各々のタンパク質の精製を進めていくことを柱とする。その上で、GM3合成酵素に関しては、GM3合成酵素の逆行輸送輸送に関わる因子のスクリーニングとGM3合成酵素と直接相互作用するタンパク質の探索を行う。また、GM3合成酵素のゴルジ体での安定性をモニタリングするために、GeneSwitchシステムとGM3合成酵素のC末端側にGFPを融合させたGM3S-GFPを組み合わせて、ライブイメージング解析系の構築を進める。哺乳動物のGM3合成酵素以外のタンパク質としては、ゴルジ体に局在するパルミトイル化酵素を解析対象とし、ゴルジ体繋留に関わる逆行輸送シグナルがあるのかどうかをまず調べていく。
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| Causes of Carryover |
予定していた物品費額よりも少なかったため、翌年に繰り越すことになった。繰越分は次年度で物品費として使用する予定である。
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