2020 Fiscal Year Research-status Report
Analysis of resistance and recognition mechanisms against pathogens in a resistance protein pair, RPS4 and RRS1
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19K05961
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| Research Institution | 岡山県農林水産総合センター生物科学研究所 |
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Principal Investigator |
鳴坂 真理 岡山県農林水産総合センター生物科学研究所, その他部局等, 流動研究員 (80376847)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 抵抗性蛋白質 / エフェクター / アブラナ科炭疽病菌 / シロイヌナズナ / 植物免疫 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
植物病原糸状菌の炭疽病菌は、1000種以上のエフェクターを宿主植物の細胞内に分泌して、宿主の抵抗反応を妨害し、その感染を成立させている。これに対して、植物は抵抗性(R)蛋白質を介して病原菌が分泌するAVRエフェクターを認識し抵抗反応を発動する。これまでに本AVRエフェクターの特定に向けて、アブラナ科炭疽病菌のゲノム情報より約300種のエフェクターを推定し、モデル実験植物Nicotiana benthamianaを用いた一過的な遺伝子発現系におけるスクリーニングを行った。また、炭疽病菌にランダムな変異を導入し、炭疽病菌に抵抗性を示す生態型Ws-2に感染する変異株の探索も試みている。しかし、現段階では、AVRエフェクターの特定には至っていない。以上により、炭疽病菌のゲノム上に存在するAVRエフェクターは単独ではなく、複数存在する可能性が示唆された。そこで、アブラナ科炭疽病菌を認識する2つのR蛋白質（RPS4およびRRS1）と特異的に反応するエフェクターを特定するため、両蛋白質とAVRエフェクターの存在下における過敏感反応（細胞死）の誘導を指標とした実験系の構築を試みた。デュアルR蛋白質システムが認識する細菌由来のエフェクター(AvrRps4およびPopP2)を用いて条件を検討した結果、CaMV由来の35Sプロモーターと翻訳活性を高めるオメガ配列の下流にエフェクター配列を導入したコンストラクトを、播種4週間後のタバコ(Nicotiana tabacum)成葉にアグロバクテリウムを介して接種することで、特異的に細胞死を誘導できたことから、新たな選抜系の構築が確立できた。
また、アブラナ科炭疽病菌およびトマト斑葉細菌病菌に対して抵抗性を誘導するデュアルR蛋白質システムにおいて、制御因子と推定されるRRS1では、C末端領域24アミノ酸が両病原菌を認識するための重要な領域であることが示唆された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
今までの解析より、アブラナ科炭疽病菌のAVRエフェクターは複数存在することが示唆されている。そこで、デュアルR蛋白質システムが認識するエフェクターの探索を中心に実験系の再構築を行った。タバコ(Nicotiana tabacum)成葉を用いた新たな実験系では、R蛋白質と既知の細菌由来のエフェクターであるAvrRps4またはPopP2をアグロバクテリウムを介して共インフィルトレートした結果、特異的に細胞死の誘導がみられ、本実験系の有効性が認められた。さらに、今年度は、今までにクローニングした90遺伝子のエフェクター候補遺伝子を過剰発現型コンストラクトへ置換し、アグロバクテリウムへ導入した。
デュアルR蛋白質システムを構成するRRS1蛋白質のC末端領域が病原菌の認識に関わっていると推察しており、C末端に変異を導入したRRS1を、RRS1蛋白質が欠損したrrs1-1変異体へ導入し、T3ホモラインについてアブラナ科炭疽病菌およびトマト斑葉細菌病菌に対する感受度検定を行った。置換箇所が病原菌の認識に関与しない場合は、機能相補により病原菌に対して耐性を示す。得られた結果から、RRS1のC末端24アミノ酸配列が両病原菌を認識する重要な領域であることが示唆された。
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| Strategy for Future Research Activity |
当初の予想通り、AVRエフェクターの同定は非常に困難である。そこで、すでに構築できているRPS4およびRRS1の両蛋白質存在下における過敏感反応（細胞死）の誘導を指標とした実験系により、過剰発現型エフェクターを導入したアグロバクテリウムを用いて、RPS4およびRRS1が特異的に認識するエフェクターの探索を行う。また、各種の炭疽病菌のゲノムが解読されたことから、アブラナ科炭疽病菌との比較ゲノム解析によりアブラナ科炭疽病菌のゲノム上に存在するエフェクターを新たに推定できた。新規の候補エフェクターについては、R蛋白質との相互作用解析を見据え、分泌シグナル配列を除くN末端に、FLAGタグ配列を挿入した過剰発現コンストラクトを作製し、アグロバクテリウムへ導入する予定である。
RRS1のC末端領域については、Ralstonia solanacearumの認識に関わっていることが示唆された（Guo et al. 2020）。本課題においても、RRS1のC末端領域が炭疽病菌および斑葉細菌病菌の認識に関わっていることが示唆されており、細胞死の誘導を指標とした実験系や、蛋白質間相互作用などの解析を行うことにより、RRS1のC末端領域が多様な病原体の認識機構に関わっていることを明らかにする。
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| Causes of Carryover |
RRS1が認識するアブラナ科炭疽病菌のエフェクターを同定するため、新たな解析系の構築を行った。これより、早期に実験系を立ち上げるための新規雇用を計画したため。
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Research Products
(2 results)
