抗生物質による無核化現象に関わる分子実体の解明

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K05965
• Research Institution: The University of Tokyo
• Principal Investigator: 西村 明日香 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 特任研究員 (70767342)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 本多 親子 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 准教授 (40343975) ; 堤 伸浩 東京大学, 大学院農学生命科学研究科(農学部), 教授 (00202185)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ブドウ / 無核化 / プロテオーム解析

Outline of Annual Research Achievements

近年、消費者の種なし志向の高まりによりブドウの無核化（種なし化）が重要な栽培技術となっている。特に需要が拡大している大粒品種においては一般的なジベレリン処理での完全無核化が困難なため、ジベレリン処理と併用して抗生物質処理を行う無核化法が広く利用されている。しかしながら、このような農業現場での抗生物質の利用は抗生物質が効かない薬剤耐性菌の出現とそれによる感染症の拡大につながる要因の一つとして世界的に問題視され始めている。
そこで本研究は、詳細機構が未解明のままである抗生物質による無核化現象の分子機構解明を通じ、抗生物質を用いない新たな種なしブドウ生産法開発のための糸口探索を目的に研究を行う。具体的には抗生物質の作用点であるタンパク質合成機構に着目し、タンパク質解析を起点とした研究により無核化に関わる分子実体の同定を目指す。
昨年度、抗生物質処理により複数の発現変動タンパク質の存在を確認・同定した。本年度はそれらタンパク質の変動レベルを明らかにするため定量的プロテオーム解析による変動タンパク質の網羅的解析を試み、各タンパク質の変動レベルの実態を明らかにした。アミノ酸やタンパク質、各種化合物の代謝に関わるタンパク質が顕著に変動することが分かった。さらにタンパク質変動による蓄積代謝物量の変化について明らかにするため、フラボノイド系代謝化合物をメインとしたメタボローム解析を行った。処理有無サンプル間で蓄積量に差がある化合物の存在を確認することができた。最終年度は本年度の解析により同定・検出された変動タンパク質や化合物に注目し、抗生物質処理による変動の再現性を確認するとともにそれらタンパク質の機能解析を進め無核化機構への関連を検討する。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

確実な実験データを得るため、当初計画では予定していなかった予備実験を初年度に行ったこと、および昨年度の結果と異なる候補タンパクの検出により実験計画を変更したため進行にやや遅れが生じている。以下に本年度の具体的な進捗を報告する。
初年度の予備実験（非ラベル法によるタンパク質の網羅的検出、比較解析）で候補となったアグレプト処理有無によるタンパク質変動の再現性の確認と変動量の定量のため、本年度はまずiTRAQ法によりラベル化したタンパク質の網羅的定量比較解析を実施した。検出された各タンパク質のサンプル間の量比（処理有／無）が2以上または0.5以下でありかつ、ジベレリン処理では変動しないアグレプト処理特異的変動タンパク質を探索した結果、2以上で11、0.5以下で35のタンパク質が同定された（プラスチドコードタンパク質は2以上、0.5以下でそれぞれ1つずつ）。しかしながらこれらタンパク質の中に昨年度の予備実験で変動が示唆されたタンパク質は含まれていなかった。サンプルは昨年の実験で用いたものと同じであることから、検出タンパク質の違いは解析手法による違いが反映されたものと考えている。同定された変動タンパク質にはアミノ酸やタンパク質、各種化合物の代謝に関わるものが多く含まれていることが分かった。
また、メタボローム解析による代謝化合物の変動を確認し、変動タンパク質の代謝系への影響の有無を検証した。フラボノイド系代謝産物をメインに解析を行った結果、処理により有意に増加する化合物を5つ、減少する化合物を1つ検出したが、それらと変動タンパク質との関連については明らかにできなかった。

Strategy for Future Research Activity

昨年同様、アグレプト処理後のシャインマスカット果粒の経時サンプリングを行い各種解析に供する。特にこれまでの解析で同定された変動タンパク質に注目し以下の解析を進める。
１．変動タンパク質をコードする遺伝子のmRNAレベルでの発現応答の有無の解析：iTRAQ解析により同定された変動タンパク質のうち遺伝子配列が明らかとなっている遺伝子を選抜しリアルタイムPCRによる発現定量比較を進める。
２．ウエスタンブロット解析による目的タンパク質の変動確認と変動時期の解析：アノテーション情報や類似タンパク質の既報により無核化への関与が推測されるタンパク質については抗体を作製しウエスタンブロットによる発現変動解析を行う。
３．関連因子、化合物の解析：上記解析によりアグレプト処理に応答した発現変動が確認されたタンパク質についてはその機能に関連する遺伝子、タンパク質、化合物等の解析を進める。
これら解析を通じて無核化関連因子の実体、無核化機構の解明に迫るための知見を蓄積し今後の研究につなげたい。

Causes of Carryover

当初計画では候補タンパク質を絞り込み、それらに対する抗体作製を進める計画であったが、候補タンパク質の選定まで至らなかったため抗体作製費用分が未使用分として生じた。抗体作製については翌年度実施予定のため繰り越して使用する計画である。