2019 Fiscal Year Research-status Report
新奇低アミロース性突然変異米を軸としたデンプン生合成メカニズムの解明
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19K05989
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| Research Institution | Hirosaki University |
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Principal Investigator |
濱田 茂樹 弘前大学, 農学生命科学部, 准教授 (90418608)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | イネ / アミロース / デンプン / 突然変異 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
食料自給率向上や安定的な食料生産の観点から、米の新規用途開発のために多様な形質をもった品種開発が望まれる。米の胚乳デンプンのアミロース含量は、炊飯米の食味の良否はもちろんのこと、米加工食品の加工適性においても重要な形質である。本研究に先立ち、自ら作製した突然変異米ライブラリーから、アミロース含量が低いにも関わらず、低アミロース米特有の玄米白濁が少なく、もち臭の低減した既存品種にはない新たな特徴を持つ低アミロース米の選抜に成功した。本課題では、この新規付加価値が期待される低アミロース性突然変異系統について、デンプンの特徴的な構造を明らかにするとともに、原因遺伝子の同定およびデンプン生合成関連遺伝子群の発現解析から形質発現の機序を解明する。得られた成果は、デンプン生合成メカニズムの解明と新規形質米育成の基盤となるものである。これまでに行った研究により、当該選抜系統では、アミロース生合成を担うWx 遺伝子の発現において、mRNA の不完全なスプライシングが増加することにより、タンパク質レベルでの酵素発現が減少することが明らかとなった。この結果は、次世代シーケンスによる突然変異候補遺伝子の絞り込みにも有益な情報となった。候補遺伝子については CAPS による遺伝解析を行うことで、低アミロース性の表現型とジェノタイプの相関を確認した。結果として、イネにおいてこれまで機能が不明だった新規 RNA binging protein を原因遺伝子として特定することに成功した。このタンパク質は、イネにおいてWx 遺伝子のスプライシングに関与することが示された。さらに、突然変異系統のデンプン構造について、アミロペクチンのグルカン鎖長解析を行ったところ、原品種と比較し15残基以下の短鎖が減少する一方で、中・長鎖が増加する特徴的なアミロペクチン構造が確認された。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和元年度の研究では、低アミロース性選抜系統の突然変異原因遺伝子の絞り込みおよびデンプン構造解析を計画した。突然変異原因遺伝子の同定については、変異体の戻し交配など、時間を要する準備は進めておいたこともあり、スムーズに解析に至った。次世代シークエンスの解析結果から、SNP-index に基づき５遺伝子まで絞り込むことができた。また、低アミロース性という表現型からアミロース合成遺伝子 (Wx) の発現解析を行ったところ、スプライシングの不具合によりタンパク質レベルでの発現低下が確認された。このことから、候補遺伝子の中にあった RNA binding proteinに着目し、CAPS マーカを構築した。CAPS マーカの遺伝解析から、低アミロース性の表現型とRNA binding proteinの遺伝型は完全に一致したことから、突然変異遺伝子の同定に至った。また、デンプン構造解析では、デンプンの80％以上を占めるアミロペクチンの構造に着目し、グルカン鎖長の解析を行った。原品種と比較し15グルコース残基以下の短鎖が減少する一方で、中・長鎖が増加する特徴的なアミロペクチン構造が確認された。このことが、本変異系統が低アミロースであるにもかかわらず、玄米白濁が少ないという特徴に関係しているものと考えられる。以上のように、当初の計画に従い実験が行われ、予定通りあるいはそれ以上の結果が出ていることから、順調に進展しているものと判断する。
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| Strategy for Future Research Activity |
令和元年度実施した研究によって同定されたRNA binding proteinが、どのようなメカニズムでスプライシング制御を行っているのか不明である。Wx 遺伝子のスプライシング制御はジャポニカタイプWxb においてのみ報告されている。そこで、同定されたRNA binding proteinがインディカタイプのWxaにも何らかの影響が示すのか解析することにした。現在は、本突然変異系統とWxaをもつ品種の交配を進めている。今後は、これらの後代についてアミロース含量とともにWxa 遺伝子の発現解析を行う。さらに、変異系統のアミロペクチン解析の結果から、当該突然変異が低アミロース性のみならず、アミロペクチン生合成にも影響していることが示唆された。アミロペクチン合成はアミロースに比べより複雑で多くの酵素が関与している。同定されたRNA binding protein が他のデンプン生合成の発現量やスプライシングに影響していないか、RT-PCR やリアルタイムPCR によって検証する。
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| Causes of Carryover |
突然変異原因遺伝子の絞り込みおよび同定の作業は困難が予想され、シークエンス解析、遺伝子関連試薬や核酸合成に多くの費用を充てていたが、得られた研究結果から効率的な絞り込みが可能となり、想定より早く原因遺伝子の同定がされた。次年度は、今年度の成果を踏まえリアルタイムPCRを用いた遺伝子発現の定量解析やゲノム抽出による遺伝解析を大規模に行う計画である。それには、PCR酵素や核酸合成など必要時の購入が望ましいため、次年度に繰り越すこととした。
計画通り、リアルタイム PCR 法を中心とした遺伝子発現解析試薬のほか、候補遺伝子のクローニング用の試薬、ゲノム抽出とイネ変異体選抜のための遺伝子試薬を中心に使用する予定である。また、その他の一般生化学試薬の購入の他、デンプン構造解析に必要な試薬や精製樹脂・カラム等の購入を予定している。
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[Journal Article] Biochemical analysis of a new sugary-type rice mutant, Hemisugary1, carrying a novel allele of the sugary-1 gene.2020
Author(s)
Takahashi S., Kumagai Y., Igarashi, H., Horimai K., Ito H., Shimada T., Kato Y., Hamada S.
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Journal Title
Planta
Volume: 251(1)
Pages: 29
DOI
Peer Reviewed
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