リンドウにおける外来遺伝子フリーのゲノム編集技術の確立

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06038
• Research Institution: Iwate Biotechnology Research Center
• Principal Investigator: 高橋 重一 公益財団法人岩手生物工学研究センター, 園芸資源研究部, 研究員 (10600033)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ゲノム編集 / リンドウ / タバコ / アグロバクテリウム / 外来遺伝子フリー

Outline of Annual Research Achievements

最近、様々な作物においてCRISPR/Cas9システムによるゲノム編集体の作出が精力的に展開されている。実用を考えた場合、外来遺伝子を有さないゲノム編集体を作出することが強く求められるが、アグロバクテリウムを介して植物ゲノムにCRISPR/Cas9システムを組み込み、ゲノム編集を行うことが一般的である。交配により当該システムを除去しnull-segregantを得た報告もあるが、栄養繁殖性の植物やヘテロシス性の高い植物への適用は困難である。DNAフリーの系によるゲノム編集も試みられているものの、効率的な系は確立されていない。そこで本研究では、リンドウ等の園芸作物を対象に、アグロバクテリウムを介してCas9およびguide RNAを植物細胞内で一過的に発現させることでゲノム編集を可能とする、外来遺伝子組み込みフリーの系の確立を目指している。併せて、環境耐性や致死性の遺伝子を活かした効率的な選抜法の開発を進めている。
令和1年度は、効率的なゲノム編集が起きる条件を検討するにあたり、PDS遺伝子の編集を指標とする可視選抜法の有効性を評価したところ、不適であることを見出した。また、致死性遺伝子であるkiss of deathが、外来遺伝子がゲノムに組み込まれた細胞の除去に有効である結果を得た。さらに、タバコにおいて、耐熱性付与遺伝子であるAtHsfA1dと熱処理を活用することで、フラボノイド合成酵素遺伝子であるNtF3Hを標的にゲノム編集を試みたところ、薬剤選抜フリーの条件下でNtF3Hのゲノム編集が起きたシグナルを示すカルスをシーケンス解析で検出することに成功した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

タバコにおいて薬剤選抜フリーの条件下で、ゲノム編集が起きることをシーケンス解析で確認することができたため。

Strategy for Future Research Activity

タバコでは解析のサンプル数を増加させ、効率的なゲノム編集の条件を明らかにする。リンドウは再分化に時間を要するが、同様の解析を進める。

Causes of Carryover

当初の研究計画で考えていた実験計画より条件検討についての期間がより必要となり、その後に計画していたスケールアップした解析のスタートが遅れた。それに伴って試薬類の消費量が計画量を下回ったため、次年度使用額が生じた。