2019 Fiscal Year Research-status Report

Molecular mechanism of linalool mediated field resistance of citrus canker disease ( Xanthomonas citri subsp. citri)

Research Project

Project/Area Number	19K06041
Research Institution	National Agriculture and Food Research Organization
Principal Investigator	島田武彦国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構, 果樹茶業研究部門, ユニット長 (10355399)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	GRAS-DI / かいよう病 / 遺伝子地図
Outline of Annual Research Achievements	温暖化の進行により被害が深刻化するカンキツかいよう病の抵抗性品種の開発に向けて、ポンカン等にみられるカンキツかいよう病圃場抵抗性の原因物質であるリナロールが抵抗性品種で高含有化されるメカニズムを明らかにする。高含有化の鍵となる原因遺伝子の同定により圃場抵抗性を有するカンキツ新品種の開発に結びつく新規知見を獲得する。本研究では、ポンカンの実生後代を用いてGRAS-ID法を用いて高密度遺伝子地図を作成し、関連遺伝子の遺伝子座、カンキツかいよう病抵抗性、リナロールの高含有化に関わるゲノム領域をマッピングし、その相関を明らかにする。また、リナロール高含有化に関わる遺伝子の同定するために、カンキツの公開ゲノム配列を基にリナロール含有量がマッピングされたゲノム領域中の予測遺伝子から、リナロールの生合成や代謝に関わる候補遺伝子を選抜する。さらに、リナロールの含有量が高いポンカン、含有量の低い「はれひめ」、及びその実生後代の葉における関連遺伝子のRNA-SEQによるトランスクリプトーム解析を行い、高含有個体と低含有個体の間で有意に発現変動する遺伝子を選抜する。この他、カンキツかいよう病原菌の接種後の増殖数とリナロール含有量の継時的変化の調査キンカン、ポンカン、ヒューガナツ等の抵抗性品種と罹病性品種について病原菌接種後16日間の菌の増殖数やリナロール含有量の継時的変化を調査する。菌の増殖パターンやリナロール含有量の変動から抵抗性の種類（静的抵抗性、動的抵抗性）を分類し、リナロールを高含有化する品種が、静的抵抗性であることを明らかにする。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 「はれひめ」とポンカンの交配で得られた実生集団94個体の成葉から全DNAを抽出し、GRAS-DI解析により、連鎖地図の作成を行った。GRAS-DI解析は、GRAS-DIライブラリーを作成し、各個体ごとにタグを付加し、PCRアンプリコンのプールを次世代シーケンサー HiSeq2500により100bpのペアエンドシーケンスを行った。カンキツのクレメンティンの公開ゲノム配列を基に、リード配列をマッピングし、親品種と実生個体間でD多型が見れるSNPを抽出した。平均で1個体あたり、3.9百万塩基配列が得られ、105,637のSNPまたは、インデルが検出された。これらの多型からトリオ解析や分離比で異常値を示すマーカーを除いた、5,384個のマーカーを用いて、JOINMAPにより遺伝子地図を作成した。「はれひめ」については、253個のSNPマーカーで構成される９連鎖群からなる714.5cMの遺伝地図を作成した。ポンカンについては、319個のSNPマーカーで構成される10連鎖群からなる934.7cMの遺伝地図を作成した。また、カンキツかいよう病菌（KC21株）を多針負傷接種法により、HP集団の葉に接種し、接種後16日後に生育しているコロニー数の調査を行った。ポンカンと「はれひめ」の接種16後のカンキツかいよう病菌のコロニー数は、 1×10E3 CFU/cM2 1.4×10E5 CFU/cM2 、コロニー数が有意に異なることを確認し、HP集団でコロニー数が遺伝子分離していることを確認した。
Strategy for Future Research Activity	HP集団のリナロールの香気成分を測定し、カンキツかいよう病のコロニー数と合わせて、 GRAS-DI解析で得られた遺伝子地図を用いて、QTL解析を行い、リナロールの含有量とカンキツかいよう病の罹病性に関わる遺伝子領域を明らかにする。検出したQTL座近傍のゲノム配列から予測遺伝子を抽出し、リナロールの含有量やカンキツかいよう病の罹病性の制御に関与する候補遺伝子を探索する。
Causes of Carryover	リナロールの高含有化に係る遺伝子を同定するために、予備的に、RNA-SEQ解析を親品種で行う予定であったが、サンプリングした葉から解析に必要な品質のRNAが採取できないため、分析を中止した。本年度は、これらのサンプルと実生集団のRNA-SEQ解析を併せて実施する予定である。