2019 Fiscal Year Research-status Report
ウイルス抵抗性遺伝子Nのエリシター応答性におけるイントロンの未知機能の解明
| Project/Area Number |
19K06047
|
|---|
| Research Institution | Tokyo University of Agriculture and Technology |
|---|
Principal Investigator |
佐々木 信光 東京農工大学, 学内共同利用施設等, 准教授 (70431971)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 植物病理学 / 植物ウイルス / 植物抵抗性 / N遺伝子 / イントロン / エリシター / 細胞死 / タバコモザイクウイルス |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
タバコのN遺伝子は代表的なウイルス抵抗性遺伝子であり，タバコモザイクウイルス由来の因子（エリシター）を認識して過敏感反応と呼ばれる抵抗反応を誘導する．この反応が誘導される際には，N転写物量が著しく増加するという特徴があるが、その遺伝子発現メカニズムや生物学的・植物病理学的意義はほとんど解明されていない．申請者は，機能未知のイントロン配列に注目した研究を行い，エリシターに応答したN遺伝子発現および効率的な抵抗性誘導にはイントロンが深く関与していることを見出してきた．そこで，本研究では，一過的遺伝子発現系および遺伝子組換え植物の実験系を組み合わせて，(1)転写活性・(2)タンパク質蓄積・(3)抵抗性誘導におけるイントロンの役割を調べ，「イントロンの機能」という新しい観点からウイルス抵抗性誘導におけるエリシター応答性の分子メカニズムの解明を目指すと共に，高度な発現制御・分子育種技術の開発に繋がる知見を得ることを目指す．令和元年度では，(1)N遺伝子プロモーターの下流にイントロン1、イントロン2あるいは両方を含むN配列を連結し，エリシター発現下における転写物量および細胞死誘導の違いを比較した．その結果，イントロン1と2の両方が揃っている場合には，効率良くエリシターに応答して転写物が増加し，細胞死が誘導されることが分かった．また，(2)35Sプロモーターの下流に連結したGFP遺伝子内にイントロン1あるいはイントロン2を挿入し，エリシター発現下での転写物量を調べた．その結果，イントロン1や2の挿入によってGFP遺伝子の転写量は増加しないことが分かった．これらの結果から，N遺伝子のイントロン1や2の機能はN遺伝子配列に依存していることが示唆された．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
令和元年度は，おおむね計画通りに実験を行うことができた。NP2.3-イントロン1とイントロン2のN遺伝子変異体を作製（実験1-1）し，それらのエリシター発現下での転写物量と細胞死誘導への影響を調べることができた（実験1-2と実験1-4）．HAエピトープタグで標識したNタンパク質のウエスタンブロット検出系を利用し，4つ全てのイントロンを含むN遺伝子（gN）とイントロンを含まないN遺伝子（cN）から合成されるタンパク質の定量を試みた（実験1-3）．35S-GFPにイントロン1あるいはイントロン2を挿入したコンストラクトを作製し、それらの転写物量への影響を調べた（実験1-5）．
|
| Strategy for Future Research Activity |
NP2.3-イントロン変異体を用いて，エリシター存在下での転写物量と細胞死誘導への影響を継続して調査を行い，定量的なデータを揃える（実験1-2と実験1-4）．HA抗体を利用したウエスタンブロット法によるNタンパク質の定量解析を行い，タンパク質量と転写物量あるいは抵抗性誘導効率との関連性について調べる（実験1-3）．35S-GFPにイントロン1とイントロン2の両方を挿入したコンストラクトを作製し、それらの転写物量への影響を調べる（実験1-5）．NP2.3配列の制御下で様々な組み合わせのイントロン変異体を発現するnnタバコおよびニコチアナベンサミアナの形質転換体を作出する（課題2）．
|
