2020 Fiscal Year Research-status Report
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19K06052
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
田中 千尋 京都大学, 地球環境学堂, 教授 (60263133)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 高浸透圧シグナル応答 / ダイカルボキシイミド / フェニルピロール / 薬剤耐性 / ゲノム比較 / メカニズム / MSUD / Meiotic Silencing |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Bipolaris maydisが浸透圧や殺菌剤を感知し応答する機構は，糸状菌に共通するSsk1経路とSkn7経路から成り立っている。本菌のイプロジオン・フェニルピロール耐性かつ高浸透圧感受性を示すDic3突然変異株は，その表現型解析からSkn7経路に関連する不全を有すると推定されており，野生型株とのゲノム配列比較の結果，酵母Prp24遺伝子のホモログ上の塩基配列多型がその表現型を支配している可能性を見出した。前年度のYeast-two-hybrid法を用いた解析により，野生型Dic3タンパク質はSkn7タンパク質だけでなく，スプライソソーム構成タンパク質Prp3とも相互作用することが明らかになった．そこで本年度はDic3タンパク質C末端のスプライソソーム構成タンパク質結合ドメインを欠損した突然変異遺伝子組換え株を作出し，イプロジオン・フェニルピロールに対する感受性変化を調べた．その結果，これらの組換え株はDic3株と同程度の薬剤耐性を示した．本実験の遂行によりイプロジオン・フェニルピロールの殺菌効果発現にはSKN7-DIC3-PRP3の相互作用が必要であることが明らかになった．また，Dic3突然変異株ならびに野生型株を供試し，薬剤処理後４時間の遺伝子発現差異をRNAseq法で解析した．また，昨年度の研究遂行により明らかになった，Dic3転座株の不稔性については，Dic3とhead-to-headで座乗する遺伝子と協調的な発現制御等の理由が考えられたが，本菌は有性生殖時にMSUD（Meiotic Silencing by Unpaired DNA）を起こすことを見出し，MSUDによりdic3ならびにDIC3の遺伝子発現が抑制され不稔化している可能性が示唆された．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度予定していた遺伝子部分欠損株の薬剤耐性評価，ならびにRNAseqについては予定通り遂行した．RNAseqのデータ解析についてもほぼ終了しているが，Dic3突然変異によるスプライシングバリアント発生の有無についての解析を継続する必要が判明し，結論を得るところまですすめられなかった．
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度の研究遂行で，B. maydisのSKN7を酵母菌内で発現させた場合，プラスミドコンストラクションによっては，酵母細胞の生育が影響を受けることが明らかになっており，SKN7，DIC3，PRP3の各タンパク質と相互作用を持つ未知タンパク質の探索にはYeast-two-hybrid法では問題が生じる可能性も考えられる．そのため，大腸菌BACTH法を併用しスクリーニングを行う．また，薬剤処理によるDIC3の局在変化の有無を調べるために，DIC3eGFP融合遺伝子を作出し，その表現型を評価し，実験を行う．
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