2019 Fiscal Year Research-status Report
植物病原糸状菌による宿主プラスチド崩壊とデンプン分解の分子メカニズム解明
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19K06056
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
八丈野 孝 愛媛大学, 農学研究科, 准教授 (10404063)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | オオムギうどんこ病菌 / デンプン / プラスチド崩壊 / グルコアミラーゼ / エフェクター |
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| Outline of Annual Research Achievements |
オオムギうどんこ病菌は、光合成を行わない表皮細胞のみに感染し栄養を摂取する。表皮細胞にはデンプンを含むプラスチドが多数存在していることをすでに見出しており、本菌の侵入部位付近に集められた後にデンプンが消失することを明らかにしている。プラスチド局在型のGFP（tpGFP）を発現させた表皮細胞でも同様に侵入部位付近にプラスチドが集まるが、分散したようなGFP蛍光も観察されていたことから、何らかのメカニズムでプラスチドが崩壊するのではないかと考えられた。そこで、本菌の付着器発芽管に含まれるタンパク質を網羅的に解析することで同定したAPEC29がグルコアミラーゼ様タンパク質であることからAPEC29がプラスチド内に移行してデンプン分解を触媒する可能性が考えられたが、APEC29-GFPを発現させた表皮細胞においてプラスチドには局在しないことがわかった。この結果からAPEC29はプラスチドには局在せず、内部のデンプン分解によるグルコースの増加による高浸透圧でプラスチドが崩壊する可能性は低いと示唆された。また、プラスチドとデンプンの動態を同時に観察するための実験系を構築した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
侵入部位付近ではプラスチド局在型GFPの蛍光が、球形のプラスチドの形ではなく分散したような状態であることから、APEC29がプラスチド内デンプンの分解を引き起こすことでプラスチドの崩壊を誘導するのではないかと考えられたが、APEC29がプラスチド内には局在しないことからその可能性は低いと考えられる。では、分散したように見えるGFP蛍光は本当に分散しているのかを調べることにした。共焦点顕微鏡でZ軸方向に多層撮影した画像をImageJにより蛍光強度を３D化して解析したところ、やはり、どのZ-スタックでも明確な球形を示さない分散した蛍光が存在することが明らかとなった。この結果から、プラスチドが崩壊している可能性は高いと考えられる。
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| Strategy for Future Research Activity |
プラスチドが崩壊することにより内部のGFPが分散する現象についてはプラスチド局在型GFPを発現させることで観察することができた。一方で、プラスチドが崩壊するのならば、内部にあるデンプンがむき出し状態になるはずである。デンプンの挙動についてはヨウ素染色で行ってきたが、GFP蛍光とは同時に観察することはできない。そこで、プラスチドに移行してデンプンに結合することが知られているGBSS（Granule bound starch synthase）を利用することとした。GBSSIをコードするWaxy遺伝子の下流にmCherry遺伝子を連結したコンストラクトと、tpGFPを同時に発現させることで、プラスチドとデンプンを同時に観察することができることをすでに確認した。今後はそこにオオムギうどんこ病菌を接種し、GFP蛍光とmCherry蛍光の動態を解析することで、本当にプラスチドが崩壊し、内部にあったデンプンがむき出しになるのかを明らかにする。また、プラスチド崩壊に関与すると考えている13-LOXについても、過剰発現あるいは発現抑制した場合のプラスチド崩壊及びデンプンの動態を解析する。
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