Evasion of plant innate immunity by complex formation between host and viral proteins

2020 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06060
• Research Institution: Nihon University
• Principal Investigator: 井村 喜之 日本大学, 生物資源科学部, 准教授 (50366621)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2022-03-31
• Keywords: ウイルス / 植物 / 宿主因子 / 抵抗性 / タンパク質間相互作用 / 細胞間移行

Outline of Annual Research Achievements

ポティウイルスに対するキュウリ近交系A192-18の抵抗性は、液胞輸送タンパク質の一つであるVps4の変異による潜性抵抗性であることを明らかにしてきた。換言すれば、ウイルスはVps4を宿主から奪取することで感染を成立させている。一方で、ウイルス感染時にVps4を過剰発現させた組織では壊死病斑が誘導され、ウイルス蓄積量は顕著に低減する。このことはウイルスは宿主の防御応答に関与する因子を積極的にハイジャックすることで、宿主からの攻撃を回避しつつ感染を成立させているものと推察できる。そこで本研究では、1)ウイルス感染におけるVps4の役割と2)Vps4による病害抵抗反応の亢進を関連付けて双方から解明することを目的としている。
令和元年度は、ウイルス感染におけるVps4の役割を理解するため、Vps4とウイルスタンパク質の相互作用を酵母ツーハイブリッド法（Y2H）により解析し、罹病性キュウリ由来のVps4タンパク質と特異的に相互作用するウイルスタンパク質を選抜した。令和２年度では、1)のさらなる解明を目指して、Vps4が変異したキュウリA192-18におけるウイルスの細胞内複製または細胞間移行の阻害について詳細に調べることとした。ウイルスゲノムRNA由来のcDNA内部にCFP遺伝子を導入し、ウイルスの組織内での挙動を蛍光顕微鏡下で観察した結果、ウイルスcDNAを接種した細胞では蛍光が観察されたが、隣接細胞への蛍光の拡大は抑制されていた。この感染パターンとウイルス蓄積量は、ポティウイルスの細胞間移行に関与するP3N-PIPOにナンセンス変異を導入したウイルスの罹病性キュウリでのそれらと同様であったことから、Vps4はウイルスの細胞間移行に関与することが判明した。さらにY2Hにおいて、Vps4がP3N-PIPOと特異的に相互作用することが再確認できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究課題は、液胞輸送タンパク質の一つであるVps4について、ウイルス側の感染における役割と植物側の防御応答における役割の相反する機能を関連付けて解析することを目的としている。令和元年度および２年度の研究では、ウイルス側の役割を中心に解析を進め、主に次の４点を明らかにすることができた。1)酵母において、Vps4タンパク質のMicrotubule interacting and trafficking (MIT)ドメインと細胞間移行に関与するウイルスタンパク質が相互作用する、2)抵抗性キュウリA192-18由来の変異型MITドメインはウイルスの細胞間移行タンパク質と相互作用しない、3)キュウリA192-18のウイルス抵抗性は細胞間移行阻害である、4)MITドメインをウイルスと共発現させると、拮抗的阻害作用によりウイルスの細胞間移行が阻害されるが、変異型MITドメインでは阻害されない。これらの現象の解明は、Vps4のウイルス感染における役割と本遺伝子の変異がもたらすキュウリのウイルス抵抗性のメカニズムに関して重要な知見が得られたものと推察でき、今年度中に国際的な科学雑誌に論文を投稿する予定である。
一方、植物側の防御応答におけるVps4の役割を明らかにするために、Vps4を過剰発現させた組織において同調的に発現変動する遺伝子群をRNA-seqにより解析した。壊疽斑点（細胞死）の誘導に先立って発現上昇する複数の遺伝子が明らかとなり、この中には防御遺伝子の発現を制御する転写因子やサリチル酸応答経路で働くタンパク質をコードする遺伝子が特定された。また、ウイルス感染に必須の宿主因子として報告されている熱ショックタンパク質も含まれていた。これらの遺伝子の発現変動とウイルスに対する防御誘導、さらには細胞死誘導との関係性を令和３年度の研究によって明らかにしていきたい。

Strategy for Future Research Activity

令和３年度は、Vps4のウイルスの感染における役割をさらに解明する目的で、1)二分子蛍光相補法による植物細胞内でのVps4と細胞間移行タンパク質との相互作用およびその局在性を明らかにすることを計画している。Vps4とウイルスタンパク質複合体の細胞内局在性を明らかにした上で、2)ウイルス感染組織におけるVps4を中心としたタンパク質複合体を免疫沈降法にて解析する。これによりVps4が関与するウイルス感染に必要な他の宿主因子を特定できるものと期待される。さらに、3)RNA干渉によりVps4を発現抑制した組織におけるウイルスの感染と蓄積量の変動を調べる。キュウリではshRNAを発現させた組織におけるウイルス蓄積量を定量RT-PCR法で解析するとともに、他の植物でのVps4のウイルス感染への関与を明らかにするために、タバコラットルウイルスベクターを用いたウイルス誘導性RNAサイレンシングによりVps4を発現抑制させたベンサミアナタバコにおけるウイルス蓄積量を同様の方法にて明らかにすることを目指す。
植物の防御誘導におけるVps4の関与を解明するにあたり、3)RNA-seqで明らかとなったVps4と同調的に発現変動する遺伝子群の中で病害抵抗反応に関与するとされる遺伝子の時間的・空間的な発現変動を調べることを計画している。さらに、4)ウイルス感染組織の封じ込めとなる壊疽斑点（プログラム細胞死）の誘導や獲得抵抗性にVps4がどのように関わっているのかを理解することを目的としている。プログラム細胞死は、その誘導に付随して発現上昇するマーカー遺伝子が複数報告されており、これらの遺伝子発現を指標に細胞死との関連性を考察する。また、獲得抵抗性にはPR-1遺伝子を代表とするサリチル酸経路で活性化する遺伝子の発現変動を定量RT-PCR法により解析することを目指している。

Causes of Carryover

令和２年度では2つの実験、すなわち、1)酵母で確認されたVps4とウイルスタンパク質の相互作用が実際のウイルス感染の場である植物細胞内で確認できるかを蛍光タンパク質再構成法により調べること、2)免疫沈降法によるVps4を中心としたタンパク質複合体の解析を計画していた。これらの実験では、当大学の共通設備である共焦点レーザー顕微鏡やLC/MS/MSなどの機器を用いて解析する必要があった。しかしながら、新型コロナウイルスの感染拡大防止措置により共有施設への入室制限が設けられたことや大学の講義形態の変更による準備に例年以上に時間を要したこと、学生の大学への入構が制限されたことなどによって計画していた実験を順調に進めることが困難な状況となった。そこで、これらの実験を令和３年度の実験計画に盛り込み、解析に必要な薬品や器具などの消耗品を令和２年度の直接経費の未使用額から充当して実験を進めることが効果的であると判断した。