2019 Fiscal Year Research-status Report
Establishment of the methylated DNA loci profiling method that reveals the past of clonal plants.
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19K06131
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| Research Institution | Tsuruoka National College of Technology |
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Principal Investigator |
南 淳 鶴岡工業高等専門学校, その他部局等, 准教授 (50270210)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | クローナル植物 / 森林生態系 / 林床植物 / DNAメチル化 / エピジェネティクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
樹木、草本のクローナル植物は森林生態系の重要な構成員であり、その群落の形成はさまざまな生物的、非生物的な作用をもたらす。しかしながら、クローナル植物はまず個体性の把握が困難であり、集団社会の把握はさらに困難である。本研究は、クローナル植物の集団形成過程を推定する方法として、メチル化遺伝子座プロファイリングを提案することにした。これはエピジェネティクスの分子基盤でもあるDNAメチル化が体細胞分裂を経て保存されることを利用したものであり、個々のラメット（機能上の個体）のゲノムDNAメチル化をMSAP法などで調べ比較することにより、ラメットの系譜を推定するものである。
本研究では矮性低木ヤブコウジを森林林床性クローナル植物のモデルとして研究材料とした。山形県鶴岡市のコナラ二次林などを調査地に設定した。(1) 群落の追跡調査のため、プロットを設定し、全ラメットにマーキングを施した（令和2年5月）。(2) 調査地で掘り起こし調査を行い、地下茎で連結した発生系譜のわかるラメットを採取した。このラメットからゲノムDNAを抽出し、MSAP法（メチル化感受性制限酵素でDNAを切断し、2段階のPCRで増幅したDNA断片を電気泳動する）で解析を行った。その結果、予想通り、親子など系譜が近いほどラメット間ではDNAメチル化遺伝子座が共通している傾向が見られた。(3) ジェネットの空間分布を解析するため、ラメットの遺伝子型を判定するためのマイクロサテライトマーカーを開発している。次世代シーケンサ利用(委託)によりヤブコウジ1個体の部分ゲノム配列情報を得た。マイクロサテライトを検索、プライマーを多数、設計した。調査地の個体に適用して、マイクロサテライトマーカーの多型性を調べている。現在のところ、ジェネットの判定に有効である4つのマーカーが得られたので、これらを用いたジェネットの解析を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
群落の追跡、マイクロサテライトマーカーの開発、掘り起こしについては予定通り進捗している。しかしながら、MSAP法によるDNAのメチル化解析について、たくさんの実験データが必要であるが、実験結果が安定せず、それに至っていない。実験プロコールを見直しているところである。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)全ラメットにマーキングを施したプロットをR2年度、R3年度に追跡調査を行い、2年間の群落の成長課程を明らかにする。(2) マイクロサテライトマーカーを確立し、これを用いて(1)とは別のプロットでヤブコウジのジェネット構造、ジェネットの空間分布を明らかにする。(3) MSAP法を効率と再現性よく実行できるプロトコールを確立する。掘り起こして地下茎で連結した発生系譜のわかるラメットを用いてMSAP法の実験を行う。統計学的手法を用いてMSAPによるDNAメチル化プロファイルからラメットの発生系譜を推定する方法を開発する。このプロファイル法とマイクロサテライトマーカーを(1)のラメットや未知ジェネット・ラメットに応用することによりDNAメチル化プロファイリング法を検証する。
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| Causes of Carryover |
遺伝子増幅装置の部品（約10万円）調達に日数がかかり、年度内に納入ができなかった。次年度に発注する。春休み中に実験補助を雇用して実験を進める予定であったが、新型コロナ流行にょる登校禁止のためできなかった。これは次年度外部業者への委託により補う予定である。
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Research Products
(2 results)
