2019 Fiscal Year Research-status Report
Development of gene knockout method using virus vector in coniferous trees
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19K06154
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| Research Institution | Forest Research and Management Organization |
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Principal Investigator |
小長谷 賢一 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所 森林バイオ研究センター, 主任研究員 等 (30582762)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
七里 吉彦 国立研究開発法人森林研究・整備機構, 森林総合研究所 森林バイオ研究センター, 主任研究員 等 (80461292)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / NPBT / スギ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年、ゲノム上の任意の塩基配列を切断するDNA切断酵素を利用し、標的遺伝子をノックアウト（機能欠失）するゲノム編集技術が新しい育種法として急速に広まりつつある。しかし、現在の技術ではDNA切断酵素遺伝子を植物ゲノム内へ一旦遺伝子組換えによって導入することが前提条件であり、導入された遺伝子の除去には交配によって遺伝分離させることが必要であることから、林木では実用化までに時間がかかる問題がある。そこで本研究では、植物に感染するウイルスをベクター（遺伝子の運搬体）として用い、植物体内でDNA切断酵素を発現させることで、遺伝子組換えを経ることなくゲノム編集する技術を開発することを目的とする。ウイルスベクターで発現させるDNA切断酵素のモデルとして特定の18塩基を認識するI-SceI遺伝子を用い、DNA切断の評価系としてI-SceI認識配列を挿入して不活化させた発光酵素遺伝子をスギへ導入する。ウイルスベクターにより発現したI-SceIによって、不活化した発光酵素遺伝子のI-SceI認識配列が切断除去されると、発光酵素遺伝子が正常化し、発光強度を指標に切断効率を評価できる。初年度はスギ用にコドンを最適化したI-SceI 遺伝子を人工合成し、ウイルスベクターであるリンゴ小球形潜在ウイルス（ALSV）へ挿入した組換えALSVを作製した。一方、評価系に使用する発光酵素遺伝子を選定し、スギで発現させた場合、Nlucが従来使用されているFlucと比較して約200倍の発光強度を有することが明らかとなった。そこで、Nluc遺伝子をベースに評価系のI-SceI認識配列挿入型GFP-Nluc融合遺伝子を作製し、現在スギへの遺伝子導入を行なっている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
初年度の計画である、I-SceIを挿入したALSVベクターの作製と、DNA切断評価用の発光酵素遺伝子を用いたコンストラクトの作製およびスギへの遺伝子導入について、計画通りに実施できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
I-SceIによるDNA切断を評価するためのI-SceI認識配列挿入型GFP-Nluc融合遺伝子を導入した組換えスギについて植物体を得る。植物体が得られるまでは、培養細胞を用いたパーティクルガンによる一過的発現系によりDNA切断の検出を試みる。
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| Causes of Carryover |
発光酵素遺伝子の解析用試薬が想定していた使用量よりも少なかったこと、また、計画していた組織培養作業について一部次年度に持ち越され、人件費が低く抑えられたため、次年度使用額が生じた。次年度は発光酵素遺伝子解析と組織培養作業が増加する見込みのため、次年度使用額は試薬費および人件費に当てる。
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