2020 Fiscal Year Research-status Report
きのこβ-1,6-グルカンを認識する新規受容体の同定
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19K06166
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| Research Institution | Utsunomiya University |
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Principal Investigator |
金野 尚武 宇都宮大学, 農学部, 准教授 (60549880)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | きのこ / β-グルカン |
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| Outline of Annual Research Achievements |
きのこ類に含まれるβ-1,6グルカンは免疫活性化機能を持つ。しかしながら、きのこ類からの単離・精製は困難である。マクロファージ様細胞（RAW264.7）からのβ-1,6-グルカン受容体を同定するためには、純粋なβ-1,6グルカンの調製が必要である。そこで、２つの手法でβ-1,6グルカンの取得を進めた。一つ目の手法として、真菌類からβ-1,6グルカンを抽出した。シイタケおよびイワタケの子実体から熱水抽出物またはアルカリ抽出物を調製し、エタノール沈殿等で高分子画分を得た。さらに、β-１,3-グルカナーゼで処理することで、β-1,3-グルカン部分を除去した。得られた生成物が基質特異性の高いβ-1,6-グルカナーゼで酵素分解されることを確認した。よって、β-1,6-グルカンであると考えられ、β-1,6-グルカンオリゴ糖の調製も可能であることを示すことができた。２つ目の手法として、β-1,6グルカン分解酵素（グルカナーゼ）の合成酵素への変換を行った。スエヒロタケ（Schizophyllum commune）およびウシグソヒトヨタケ（Coprinopsis cinerea）由来のβ-1,6-グルカナーゼのれぞれ活性中心残基のグルタミン酸をグリシン、アラニン、セリンにそれぞれ変換し得られた合成酵素を作成し、リコンビナントタンパク質をこうじ菌を用いて異種発現させ精製した。。得られた酵素をそれぞれ100ｍM酢酸ナトリウムバッファー（pH5.0）、20ｍMフッ化ゲンチオビオース、20℃、48ｈの条件で反応させた。生成物を検出したところ、収量は少ない物の２糖以上のオリゴ糖と多糖が検出でき、β-1,6-グルカンの合成に成功したと考えられた。現在、得られた生成物の構造解析とRAW264.7を用いた機能性評価を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2020年度は細胞培養試験、大量培養を進める予定であったが、新型コロナウイルスの感染拡大防止への対応のため、研究室の部分的な閉鎖があり、細胞培養についての継続的な実験ができなかった。そのため、材料であるβ-グルカンの調製を中心に行った。
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| Strategy for Future Research Activity |
2020年度までの実験で調製することができたβ-1,6-グルカンを用い機能性試験行う。β-1,3-グルカン、β-1,6-グルカンおよびβ-1,3/1,6-グルカンでそれぞれ処理したRAW264.7細胞を回収し、RNAシークエンスを行う。発現している遺伝子群を比較することでβ-1,6-グルカン受容体の同定につなげる。また、大量培養した細胞からタンパク質群を抽出し、β-1,6-グルカン結合能を持つタンパク質を各種クロマトグラフィーを用いて精製する。
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| Causes of Carryover |
コロナ禍の影響から実験の制限を余儀なくされ、細胞培養試験などが予定通りに実施できなかった。また、実験補助員の雇用、研究発表用の旅費などの支出も制限されたため、次年度使用額が生じている。
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