2020 Fiscal Year Research-status Report
マツタケ単核体の取得、および遺伝子導入と破壊法に関する研究
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19K06175
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| Research Institution | Kindai University |
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Principal Investigator |
福田 泰久 近畿大学, 農学部, 講師 (80609602)
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2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | マツタケ / トキイロヒラタケ / 形質転換 / 単核体 / プロトプラスト / 細胞壁消化 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
現在までにマツタケの形質転換法に関する報告は、Agrobacteriumによる感染法が報告されている。しかしながら、この手法を用いたマツタケの遺伝子組換えを行った報告はいままでにない。おそらく、手法として非常に難しいために再現性が乏しく、偶然性が占める割合が多い手法であることが考えられる。マツタケやヒラタケなどの糸状性担子菌類微生物の形質転換法の主流は、細胞壁を消化してプロトプラストを大量に獲得し、ポリエチレングリコール（PEG）によってベクターを細胞内へ導入する方法が主流で行われている。しかしながら、現在までにマツタケにおける報告はない。本研究課題では、マツタケの形質転換技術を開発することを目的に研究を行っている。
マツタケのプロトプラスト‐PEG法による形質転換法確立のための重要な要因は、如何にプロトプラストを大量に生成させることができるかである。
様々な細胞壁の消化手法がうまく働かない原因は、マツタケの細胞壁が他の担子菌類とは大きく異なるためと予測される。そこで、市販品の酵素を用いるのではなく、自然界からマツタケの細胞壁を分解する微生物の分離を試みた。現在まで、マツタケ細胞壁不溶画分寒天培地において、ハローを形成する菌株を2種類獲得し、それらの微生物由来の生産酵素の解析と、培養液の濃縮物を用いてマツタケプロトプラスト形成条件の検討を行っている。
本年度は、本研究課題に関連する社会への報告として、トキイロヒラタケの形質転換宿主株に用いる目的の単核体分離に関する論文1報、その単核体で実際に形質転換技術を確立した論文1報を報告し、トキイロヒラタケ子実体形成時に変動する遺伝子の網羅的な解析について、学会発表を1件行った。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
本年度の研究成果として、マツタケプロトプラスト形成を目的に、マツタケ細胞壁分解微生物のスクリーニングを行った。その結果、現在までに2株分離することができた。分離された微生物はコロニー形態より細菌類であることが予想されたため16SrDNA配列を解読したところ、Streptomyces属、Paenibacillus属の細菌であった。これらの微生物が生産する細胞壁消化酵素群を解析するとともに、大量培養、酵素抽出してプロトプラスト形成が大量に生じるか現在検討中である。
しかしながら、依然マツタケの形質転換までには至っていない。1千万個ほどのプロトプラスト量では、形質転換どころか、プロトプラストの再生も現在のところ確認できていない。
このように、マツタケプロトプラスト調整法が未だ確立されていないため、研究は遅れている。しかしながら、効率的な細胞壁消化が期待される微生物を自然界より分離同定した。それらを踏まえ、現段階の実験進捗状況はやや遅れていると判断した。
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| Strategy for Future Research Activity |
2021年度には、引き続き第一にマツタケ菌糸の新鮮な再生が期待されるプロトプラスト調整法を確立することを目標にする。2020年度では様々な市販酵素類を用いたが、形質転換や再生が確認されるほどのプロトプラストの形成ができなかった。このことを受け、マツタケの細胞壁を分解する微生物を分離した。分解微生物のスクリーニングは引き続き行い、現在取得している細菌類については、生産酵素の解析を詳細に行う。菌対外酵素に注目し、培養液をSDS-PAGEに供し、確認されるタンパクをMALDI-TOF-MASSで網羅的に解析する。
また、そもそもマツタケの細胞壁成分の詳細は不明であるため消化生産物の解析により決定する。分画されたそれぞれの成分は、基質特異性が高い酵素を用いた酵素消化により、生成物を同定することで決定していく。
さらに、関連研究であるトキイロヒラタケの確実な遺伝子ターゲッティングを可能にするため、Ku80遺伝子破壊株の作出を行う。
それぞれの成果は、現在までに報告されていない事柄であるため、随時論文発表をする予定である。
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| Causes of Carryover |
本年度、マツタケ細胞壁分解微生物の16SrDNA配列決定のため、受託解析を依頼予定であったが、PCRに用いるプライマーがうまくマッチせず当時は遺伝子増幅を確認できなかったため、未使用額が生じた。
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