ゲノム科学等の先端技術を活用したノリのプロトプラスト作成法の再興と簡便化

2022 Fiscal Year Annual Research Report

• Project/Area Number: 19K06188
• Research Institution: Saga University
• Principal Investigator: 関 清彦 佐賀大学, 農学部, 講師 (00264151)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 濱 洋一郎 佐賀大学, 農学部, 教授 (00243999) ; 永野 幸生 佐賀大学, 総合分析実験センター, 准教授 (00263038) ; 川村 嘉応 佐賀大学, 農学部, 招へい教授 (30601603) ; 後藤 正利 佐賀大学, 農学部, 教授 (90274521)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: スサビノリ / プロトプラスト / アガラーゼ / ポルフィラナーゼ / キシラナーゼ / マンナナーゼ

Outline of Annual Research Achievements

ノリの迅速種苗化、新品種作出に貢献可能なノリプロトプラストの、ゲノム科学等の先端技術を活用した作成技術の再興と簡便化を図ることを目的とした。ノリプロトプラスト調製のために、ノリの細胞間充填多糖であるポルフィランおよび細胞壁構成多糖であるマンナンとキシランを分解する酵素の生産菌を有明海泥土（4カ所）からスクリーニングした。その結果、全ての海泥土試料から各基質を分解する細菌を単離できた。各基質においてハロー形成が顕著であった細菌のゲノム解析を実施し、DFASTを用いた注釈付けにより酵素遺伝子を同定、配列情報を取得した。
ピキア酵母発現に最適化した酵素遺伝子発現プラスミドを合成し、組換え酵素高生産を試みた。組換えタンパク質の高発現（1 Lあたり、400 mgから1500 mg）には成功したが、酵素活性を示さないタンパク質も多かった。酵素活性を示さなかったタンパク質について、細菌ブレビバチルス分泌発現系を用いた菌体外高生産を試みたところ、組換え酵素の生産に成功した（1 Lあたり、200 mgから1400 mg）。
ノリ葉状体を、2％パパインにより処理後、ポルフィラナーゼ、β-1,4-マンナナーゼ、β-1,3-キシラナーゼを用いて細胞壁を溶解した。細胞壁溶解酵素液10 mL中に、各酵素が1 unit、0.5 M マンニトールを含む20 mM HEPES緩衝液（pH7.5）で調製し、120分作用させたところ、プロトプラスト形成が確認された。また、細胞間充填多糖であるポルフィランの分解酵素添加量を上昇させることにより細胞の分離時間が短くなり、細胞壁構成多糖であるβ-1,4-マンナナーゼおよびβ-1,3-キシラナーゼの添加量を増やすことにより、プロトプラスト形成効率が上昇した。ゲノム科学等の先端技術を用いることにより容易にかつ短期にプロトプラスト作成技術を得ることが可能になった。