好低水温性赤潮藻のシスト発芽能評価に基づく赤潮発生予察技術の開発

2019 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06211
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 吉川 毅 鹿児島大学, 農水産獣医学域水産学系, 教授 (10295280)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 好低温性赤潮 / 生活環 / シスト / 赤潮予測 / 定量PCR

Outline of Annual Research Achievements

好低温性赤潮原因藻類の一種、ディクチオカ藻綱Pseudochattonella verruculosaは高い魚毒性を持ち、しばしば漁業被害を与えている。令和元年度は、定量PCR（qPCR）による本藻モニタリング技術の開発を目的として、以下の実験研究を行った。
細胞あたりのコピー数が高いと期待される葉緑体DNAに着目し、24.6 kbpの部分塩基配列を決定した。この領域には光化学系、リボゾームタンパク質、シャペロン、ATP生合成関連酵素群、トランスファーRNAなどの遺伝子がマッピングされた。そのゲノム構造は、ディクチオカ藻綱の他種（Han et al., 2019）とは大きく異なっていた。本綱を構成する各々の種が進化の過程で分岐したのちに、ゲノムの再編成が生じたと考えられる。
高い種特異性を期待し、本藻葉緑体ゲノムの遺伝子間領域に定量PCR（qPCR）用ヌクレオチドプライマーを設計した。本プライマーセットの応用可能性について、赤潮現場海域のモデル系を構築して検証した。細胞数既知の本藻培養細胞を天然海水および海底泥に添加し、環境DNA（eDNA）を調製した。eDNAを鋳型にqPCRを行い、本藻細胞数に基づく検量線を作成した。その結果、葉緑体ゲノム上に設計したプライマーは核ゲノムのそれより高い定量性および特異性を示した。また、eDNAの抽出効率を考慮することにより定量性が向上した。以上のことから、本プライマーセットが細胞数の定量に有用であることが示された。
鹿児島県山川湾では、2012年2月に本藻ブルームが発生している。そこで、ブルーム発生以降に同海域から採取した海底泥について、qPCRによる本藻の定量化を試みた。しかしながら本藻の検出には至っていない。底泥中の細胞密度がきわめて低いためと推察される。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本年度は、以下の点について実施する予定であった。1) Pseudochattonella verruculosa葉緑体ゲノム上の遺伝子間領域について塩基配列を決定する、2) 本藻を特異的に検出するための定量PCR（qPCR）用プライマーを設計する、3) qPCRによる本藻の定量化法を確立する。
1) については、葉緑体ゲノム上24.6 kbpの部分塩基配列を決定した。オープンリーディングフレーム解析と相同性検索により光合成やタンパク質合成、エネルギー代謝に機能する遺伝子群がマッピングされ、遺伝子間領域が特定された。したがって、1) の目的は達成されたと判断される。
2) と3) については、葉緑体ゲノム部分配列の解析結果に基づき、遺伝子間領域に複数のプライマーを設計した。構築した赤潮現場海域のモデル系に対して本プライマーセットを適用した。その結果、核ゲノム上に設計された既報のプライマーセットと比較して高い定量性および特異性を得た。また、環境DNA調製時に指標DNA断片を添加し、その抽出効率を評価した。得られた抽出効率に基づいてqPCRの測定値を補正することにより、定量性が向上した。以上のことから、2) および3) の目的を達成したと考える。

Strategy for Future Research Activity

1) 赤潮原因藻Pseudochattonella verruculosaについて、シスト形成から休眠、成熟、発芽の各段階を誘導する環境要因（温度、照度、栄養条件など）を解明し、in vitroで本藻の生活環を完結させる系を確立する。また、本藻の生活環と葉緑体ゲノムコピー数の相互関係を明らかにし、定量PCR（qPCR）により本藻細胞数を評価する際の精度向上を図る。
2) 渦鞭毛藻類では、シストにおける鞭毛関連遺伝子の発現抑制が報告されている（Jang et al., 2017など）。そこで、当初の計画で示した葉緑体ゲノム上の光合成関連遺伝子に加え、鞭毛関連遺伝子などシストで発現が活性化または抑制されると推測される遺伝子をクローニングする。これらの遺伝子について、逆転写定量PCR（RT-qPCR）などの手法を用い、生活環の各ステージ、とくにシストでの発現量の増減を明らかにする。可能であれば、メッセンジャーRNAの網羅的解析（トランスクリプトーム解析）を実施し、生活環の各ステージ特異的に発現が制御される遺伝子群を特定する。これらの情報をもとに、シスト成熟期およびシスト発芽期特異的な分子指標を確立する。
3) 本藻赤潮の発生履歴がある鹿児島湾山川湾など、南九州海域に調査定点を設け、確立した分子指標により現場海域での本藻細胞数の推移を明らかにする。あわせて、本藻シストを定量化し、その発芽能を評価する。現場海域での調査が困難な場合は、本藻培養細胞を用いてモデル系（ミクロコスむ）を構築し、同様の実験を行う。
4) 以上の研究で得られる成果をもとに、本研究で採用した手法の赤潮予測への応用可能性を考察する。また、本成果を赤潮現場海域での赤潮発生予測および赤潮防除法の提言につなげる。

Causes of Carryover

当初購入を予定していた卓上微量高速遠心機（当初見積額616,000円）について、同一性能でより安価な機種（支出額416,955円）を選定したことにより、約20万円の節約が可能となった。また、本年度は、さほど試行錯誤を繰り返すことなく順調に研究成果が得られ、ほぼ予定どおりの進捗を見た。そこで、令和3～4年度に実施予定であった赤潮現場海域での本藻の定量化について一部検討を行った。この実験には本事業開始前に採取、調製した試料を用いており、あらたな支出を要しない。以上のことから、当初の予定額を下回る支出となった。
次年度は、当初の計画に加え、メッセンジャーRNAの網羅的解析（トランスクリプトーム解析）の実施を検討している。この実験により、赤潮原因藻Pseudochattonella verruculosaのシストで特異的に発現が制御される遺伝子群の特定が可能となる。これらの遺伝子群の発現をモニタリングすることにより、現場海域に存在する本藻シストの発芽可能性を評価できる。そこで、次年度使用額は、当該実験に要する試薬やトランスクリプトーム解析の外注などに充てる予定である。