好低水温性赤潮藻のシスト発芽能評価に基づく赤潮発生予察技術の開発

2021 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 19K06211
• Research Institution: Kagoshima University
• Principal Investigator: 吉川 毅 鹿児島大学, 農水産獣医学域水産学系, 教授 (10295280)
• Project Period (FY): 2019-04-01 – 2023-03-31
• Keywords: 好低温性赤潮 / 生活環 / 休眠細胞 / 赤潮予測 / 遺伝子発現

Outline of Annual Research Achievements

高い魚毒性を示す好低温性赤潮原因藻類の一種、ディクチオカ藻綱Pseudochattonella verruculosaについて、その無菌培養株の確立、全RNAの調製法、および生活環（増殖）各段階での遺伝子発現の推移の解明に取り組んだ。
P. verruculosaの無菌培養株の確立を目的として、ペニシリン、ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、ポリミキシンB、テトラサイクリンからなる抗生物質混液を本藻培養液に添加し経時的に観察した。その結果、抗生物質混液の濃度に関わらず本藻の遊泳停止、細胞集塊の形成を認め、最終的にすべての細胞が溶解死滅した。本藻の無菌化法について今後の課題である。
逆転写定量PCR（RT-qPCR）による光合成関連遺伝子発現量の定量化を目的とし、RNA抽出キットを用いてP. verruculosaから藻体RNAを調製した。その結果、顕著なゲノムDNAの混入を認めた。得られた藻体RNAをDNA分解酵素で処理することにより、ゲノムDNAの混入が逆転写PCRで検出されない程度に抑制された。したがって、本藻のRT-qPCRにおいてはRNA抽出後のDNA分解酵素処理が必須であると考えられる。
P. verruculosaを培養しその一部を経時的に採取することにより、生活環（増殖段階）における遊泳細胞から非遊泳性細胞集塊までの各段階の細胞を回収した。上述の手順に基づき藻体DNAを調製し、光合成関連遺伝子、特に光化学系II D1タンパク質遺伝子psbAの発現量を逆転写定量PCR（RT-qPCR）にて定量化した。その結果、生活環のうち細胞集塊形成期にその発現量が低下する傾向が見られた。したがって、psbAに代表される光合成関連遺伝子の発現量が天然環境中での本藻の生活環各段階の指標となりうる可能性が示唆される。他の光合成関連遺伝子も含め、その再現性を確認する予定である。

Current Status of Research Progress

3: Progress in research has been slightly delayed.

Reason

令和3年度は、以下の点について実施する予定であった。1) 赤潮原因藻Pseudochattonella verrculosaの生活環をin vitroで完結させる系の確立、特に非遊泳性細胞集塊（休眠細胞）からの遊泳細胞の形成・遊離を誘導する環境要因の解明　2) 休眠段階（非遊泳性細胞集塊）特異的な分子指標の確立　3) トランスクリプトーム解析による各ステージ特異的発現遺伝子の把握
1) については、培養系にて単細胞性遊泳細胞の融合および細胞集塊形成までの過程を確認している。しかしながら、細胞集塊からの遊泳細胞の形成、その後の遊泳細胞の分裂増殖を確認するには至っていない。その要因として、培養株に共存する細菌、その細菌による細胞集塊の溶解、死滅が考えられる。本藻培養株の無菌化も試みているものの、本藻自体が抗生物質に対する感受性が高く、抗生物質処理に代わる無菌化法を検討する必要がある。
2) および3) については、生活環（増殖）各段階の光合成関連遺伝子発現量を評価し、その挙動をある程度捉えている。しかしながら、結論を得るためには、その再現性の確認に加え、1) の生活環を完結させる系の確立、その前提条件となる本藻培養株の無菌化が求められる。
以上のことから、特に1) についての進捗状況に遅れが生じていると判断される。

Strategy for Future Research Activity

1) 赤潮原因藻Pseudochattonella verruculosaの無菌培養株を確立した上で、非遊泳性細胞集塊（休眠細胞）からの遊泳細胞の形成、遊離を誘導する環境要因を解明し、in vitroで本藻の生活環を完結させる系を確立する。また、本藻の生活環と光合成関連遺伝子発現量の相互関係を明らかにし、細胞集塊（休眠細胞）形成および遊泳細胞の形成と増殖（ブルーム化）の分子指標としての可能性を検討する。
2) 渦鞭毛藻類では、休眠細胞（シスト）での鞭毛関連遺伝子、植物ホルモン生合成遺伝子、エネルギー代謝関連遺伝子などの発現抑制が報告されている。そこで、光合成関連遺伝子に加え、これらの遺伝子のクローニングを本藻において試みる。クローニングされた各遺伝子について、逆転写定量PCR（RT-qPCR）などの手法を用い、生活環の各ステージでの発現量の推移を明らかにする。また、メッセンジャーRNAの網羅的解析（トランスクリプトーム解析）を実施し、生活環の各ステージ特異的に発現が制御される遺伝子群を特定する。以上の情報をもとに、赤潮ブルーム形成の端緒となり得る遊泳細胞形成・遊離段階に特異的な分子指標を確立する。
3) 本藻赤潮の発生履歴のある南九州海域に調査定点を設け、確立した分子指標の現場海域への応用を試みる。現場海域での調査が困難な場合は、モデル系（ミクロコスム）を構築し、分子指標の有用性について検討する。
4) 以上の成果をもとに、本研究で採用した手法の赤潮予測への応用可能性を考察する。

Causes of Carryover

令和3年度は、赤潮原因藻Pseudochattonella verruculosaの無菌株が得られず、本研究の実施にあたって重要な本藻生活環を完結させる系が確立できなかった。そのため、当初予定していた鞭毛関連遺伝子のクローニングとその生活感覚ステージでの発現量の解析、メッセンジャーRNAの網羅的解析（トランスクリプトーム解析）の実施に至らず、関連する実験研究に要する支出が当初の想定を下回ることとなった。
令和4年度は、細胞集塊（休眠細胞）および細胞集塊から形成される遊泳細胞に特異的に発現が制御される可能性のある遺伝子群の解析を行う予定である。そのための遺伝子クローニング、トランスクリプトーム解析、逆転写定量PCR（RT-qPCR）の実施を検討している。これらの実験により、本藻の細胞集塊（休眠細胞）およびその後のブルーム形成に至る各段階で特異的に発現が制御される遺伝子群の特定が可能となる。そこで、令和4年度使用額は、これらの実験に要する試薬やトランスクリプトーム解析の外注に充当する予定である。なお、本課題研究については、新型コロナウイルス感染症の影響による進捗状況の遅れも踏まえ、補助事業期間の延長も検討する予定である。