2019 Fiscal Year Research-status Report
菌叢中の “単離できない微生物”の役割を可視化する革新的菌叢解析技術の開発
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19K06230
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| Research Institution | Niihama National College of Technology |
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Principal Investigator |
喜多 晃久 新居浜工業高等専門学校, 生物応用化学科, 准教授 (00555162)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡村 好子 広島大学, 統合生命科学研究科(先), 准教授 (80405513)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | RHa-RCA法 / in situ RHa-RCA-FISH法 / mRNA特異的蛍光標識 / キチン分解菌叢 / 嫌気的キチン分解 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究の目的は、水産加工の際に大量に生じるキチン含有廃棄物を高効率に分解することができる、キチン分解菌叢を構成する微生物群の個々の役割を明らかとすることである。令和元年度は、以前の研究で得られたRNA-seqによるキチン分解菌叢の転写情報から、chitinase、glucosamine-6-phosphate deaminase、N-acetylglucosamine deacetylaseなど、キチン分解に関与すると推定される17の遺伝子を抽出した。一方、菌叢による嫌気的キチン分解がいかにして行われているのかを解明するためには、菌叢中の個々の微生物が「何を」やっているのか明らかにする必要がある。そのため、本研究において、任意の配列のmRNAを特異的に増幅・検出する RNase H-assisted rolling circle amplification (RHa-RCA)法の最適化を行った。RHa-RCA法を微生物細胞に応用し、mRNAを細胞内蛍光検出することで、キチン分解関連遺伝子を発現している微生物の特異的検出が可能になる。また、菌叢には細胞壁構造の異なる多様な細菌が共存していると考えられるため、細菌種に依存せず、プローブや酵素を導入し細胞内反応を可能にする、細胞壁透過方法が必要となる。そこで、細胞壁構造の異なる2種のモデル細菌混合物に対して、細胞透過方法の検討を行った。その結果、エタノールとリゾチームによる処理後に反応を行った際、いずれの細菌細胞からも高い効率で特異的蛍光を得た。このことから、細菌種によらず菌叢のmRNA特異的蛍光標識が可能であるとわかり、今後、菌叢内のキチン分解を行う個々の微生物を蛍光標識し、栄養共生関係を可視化することが可能だと考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
既に取得しているRNA-seq情報から、代謝経路マッピングによって、本菌叢におけるキチン分解に関与すると推定される遺伝子情報を抽出した。また、それら遺伝子を持つ微生物群を可視化にむけて、細胞内でRHa-RCAを行いFluorescence in situ hybridization（FISH）により蛍光標識するin situ RHa-RCA-FISH法を確立した。さらに、グラム陰性・陽性細菌を混合したモデル系を用いて、複合菌叢におけるin situ RHa-RCA-FISHの反応条件を確立し、既知の栄養共生菌叢に適用した結果、遺伝子発現特異的に特定細菌が蛍光標識できることが確かめられた。これにより、キチン分解菌叢に適用することが可能となった
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| Strategy for Future Research Activity |
まず、キチン分解菌叢に特異的なin situ RHa-RCA-FISHを実施し、標的となる微生物の可視化を行う。その後、当初の計画通り、FACSソーティングによる標的微生物の分離取得と全ゲノム決定を行い、キチン分解代謝経路や栄養要求性などを明らかにする。そして、その情報をもとに標的微生物の単離を行っていく。
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| Causes of Carryover |
当初購入予定だったロールチューブ作製器が生産中止となっており、購入できなかったため。また、遺伝子実験の準備が遅れたため、電気泳動装置等を購入しなかった。次年度は遺伝子実験のための装置や試薬等の消耗品、DNAシーケンスなどの委託解析費、現在準備中の論文の英文校正費などを計上している。
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