2019 Fiscal Year Research-status Report
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19K06232
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| Research Institution | Tohoku University |
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Principal Investigator |
長 由扶子 東北大学, 農学研究科, 助教 (60323086)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
日出間 志寿 福島県立医科大学, 医学部, 助教 (30241558)
小池 一彦 広島大学, 統合生命科学研究科(生), 教授 (30265722)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
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| Keywords | 生合成 / 免疫染色 / サキシトキシン / LC/MS / 安定同位体標識 / 渦鞭毛藻 / 免疫電顕 / オルガネラ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
【１．阻害剤によるSTX中間体輸送体の探索】有毒渦鞭毛藻を安定同位体標識硝酸ナトリウム培地で培養する際に既知のアミノ酸輸送体の阻害剤、アミノ酸生合成酵素の阻害剤あるいはSTX生合成抑制作用のある代謝阻害剤を添加して経時的にサンプリングし、isotopomer分布を解析した。MSMSでカルバモイル硫酸由来フラグメントイオンの15N取り込みを解析した。15N取り込み挙動の変化からアミジノ基とカルバモイル基転移反応が異なるオルガネラで進行し、その際中間体が輸送されるのではないかという仮説を提唱した。
【２．STX生合成マシナリーの局在オルガネラの同定】まず初発の生合成酵素の局在オルガネラの特定を試みた。アルギニンから生合成中間体Int-A'を生成する酵素であるSxtAを構成している４つのドメインのうち、ふたつのドメインのペプチド抗体を用いた免疫学的手法を開発し、共焦点レーザー顕微鏡観察により渦鞭毛藻の有毒株で両シグナルは同じオルガネラに局在すること、SxtA4タンパク質シグナルの有無は毒性とよい相関を示すことを確認した。さらにオルガネラ特異的蛍光色素やオルガネラ特異的抗体による蛍光シグナルと局在を比較してSxtA局在オルガネラの候補を絞り込んだ。渦鞭毛藻の有毒サブクローンを免疫化学的電子顕微鏡観察に供し、抗SxtA抗体による金コロイドシグナルが局在するオルガネラを特定した。
【３．有毒、無毒サブクローンのsxtA遺伝子コピー数の比較】市販のキットでAlexandrium tamarenseの有毒、無毒株のsxtAコピー数を調べたところ、有意差がないことが明らかとなった。転写以降の段階のどこかで差が生じ、SxtAタンパク質発現の差が観察されたものと推定された。
本研究で得られた成果により渦鞭毛藻における麻痺性貝毒の生合成から代謝までのダイナミクス研究が大きく発展することが期待できる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
【１．阻害剤によるSTX中間体輸送体の探索】作用機序の既知の阻害剤でのisotope分布の変化を作用未知のEdUやコルヒチンにおける変化と比較したところ、EdU及びコルヒチンの作用点が前駆体であるアルギニンの合成より上流であることが確認された。コルヒチンでプロテオリティックなアミノ酸のサキシトキシン生合成への関与が示唆されたこと、アミノ酸輸送体の阻害活性の知られるニゲリシンで中間体量が大きく減少したことを考え合わせると、サキシトキシン生合成に輸送体が何らかの役割を果たしていることが強く示唆され、期待通りの成果が得られた。統計学的な解析においてコルヒチン添加系のisotopomer分布実測値と当初モデルでの予測値のずれを見出し、その原因追及の過程で最適化プログラムへのマルコフ連鎖、モンテカルロ法の応用による高速化へと発展した。その結果渦鞭毛藻の細胞内におけるサキシトキシン生合成反応場と中間体輸送について新たな作業仮説を提案することができた。さらに当初の計画にはなかった実験によりコルヒチン添加系ではカルバモイル基の窒素の15N取り込み率が特に低下していることを明らかにするなど予期していない成果が得られた。これらの知見をもとに新しい展開が期待できる。
【２．STX生合成マシナリーの局在オルガネラの同定】古くから渦鞭毛藻のサキシトキシン生合成が何らかのオルガネラにおいて進行するのではないかと推定されてきたが、今回初めて初発の反応を触媒する酵素のオルガネラが特定された。共焦点レーザー顕微鏡観察においてオルガネラ特異的抗体との共局在のみならず、発現の変動に関しても有用な情報が得られつつある。生合成や代謝の制御機構の理解へとつながる鍵となる知見であり、当初計画していた以上に進展していると判断した。
現在上記の２つの結果を論文にまとめている。
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| Strategy for Future Research Activity |
【１．STX生合成関連マシナリー発現の時期依存性】本年度はサキシトキシン生合成初期の反応を司るSxtA及びSxtGの遺伝子、タンパク質発現量の時間的変化とサキシトキシン生合成中間体及び類縁体生成量の時間的変化の相関を明らかにする予定である。無毒株のSxtAタンパク質発現量がどの時期でも著しく低下しているかどうかを調べる。
【２．SxtGの細胞内局在】昨年度SxtAについて確立した免疫染色のプロトコールをサキシトキシン生合成経路で2番目の反応であるアミジノ基転移反応を司るSxtGにも応用して、有毒種、無毒種での分布及び細胞内局在部位を調べる。免疫電顕でも微細構造を調べ、SxtAの局在と比較する。
【３．生合成反応場と蓄積オルガネラの同定】SxtA及びSxtGの発現量の高いタイミングで細胞を収穫後オルガネラを単離し、安定同位体標識基質を用いたin vitro変換反応によって化学的に局在と活性が一致することを証明する。分画毎に含有オルガネラの指標となる活性あるいは成分も併せて測定する。昨年度提唱した初発の縮合反応と2番目のアミジノ基転移反応が異なるオルガネラで進行すること、アミジノ基転移反応の進行するオルガネラが複数あるのではないかという仮説を検証する。
【４．輸送体遺伝子の探索】昨年度の代謝阻害剤の実験で前駆体及び中間体の輸送体の存在が示唆されたため、植物や藻類で既知の輸送体の遺伝子配列から縮重プライマーを設計してクローニングする。
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Research Products
(15 results)
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[Presentation] Isolation and structural elucidation of tetrodotoxin related compounds from pufferfish2019
Author(s)
Yaegashi, Y., Ueyama, N., Kudo, Y., Cho, Y., Konoki, K. and Yotsu-Yamashita, M.
Organizer
Tohoku University’s Chemistry Summer School
Int'l Joint Research
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[Presentation] Screening of novel secondary metabolites from microorganisms associated with the marine sponge Halichondria okadai2019
Author(s)
Goto, M., Kikuchi, S., Okada, K., Cho, Y., Yotsu-Yamashita, M. and Konoki, K.
Organizer
Tohoku University’s Chemistry Summer School
Int'l Joint Research
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[Presentation] Sensitivity of the voltage-gated sodium channel subtypes, Nav1.1 to Nav1.7, against guanidine-containing natural products and their analogues2019
Author(s)
Tsukamoto, T., Chiba, Y., Tsunogae, S., Yamada, T., Cho, Y., Sakakibara, R., Imazu, T., Tokoro, S., Satake, Y., Ishikawa, Y., Nakane, Y., Mouri, S., Yamamoto, Y., Adachi, M., Nakazaki, A., Nishikawa, T., Wakamori, M., Yotsu-Yamashita, M. and Konoki, K.
Organizer
The 1st International Symposium on the Chemical Communication
Int'l Joint Research
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[Presentation] Identification of biosynthetic intermediates of amnesic shellfish toxin domoic acid and anthelmintic compound kainic acid2019
Author(s)
Maeno, Y., Kotaki, Y., Terada, R., Cho, Y., Konoki, K. and Yotsu-Yamashita, M.
Organizer
Gordon Research Conference, Mycotoxins and Phycotoxins
Int'l Joint Research
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