2019 Fiscal Year Research-status Report
Structure and function of pufferfish toxin, tetrodotoxin, binding proteins as biological defense agent
| Project/Area Number |
19K06241
|
|---|
| Research Institution | Niigata Agro-Food University |
|---|
Principal Investigator |
長島 裕二 新潟食料農業大学, 食料産業学科, 教授 (40180484)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
岡井 公彦 東京海洋大学, 学術研究院, 助教 (00596562)
佐藤根 妃奈 新潟食料農業大学, 食料産業学科, 助教 (60579291)
木谷 洋一郎 金沢大学, 環日本海域環境研究センター, 助教 (70565340)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | 水産学 / 生体分子 / テトロドトキシン / 機能性タンパク質 / 生体防御 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
フグをはじめフグ毒テトロドトキシン（以下TTXと略記）をもつ動物はTTX投与に対して高い抵抗性を示し、これがTTX保有動物のTTXに対する生体防御機構の1つと考えられている。このTTX耐性には、TTXが特異的に作用する末梢神経Naイオンチャネルのアミノ酸変異によるTTX不感受性と、組織に存在するTTX結合タンパク質による減毒が関与している。そこで本研究では、生体防御物質としてのTTX結合タンパク質の役割を明らかにするため、1）TTX結合タンパク質の組換えタンパク質を合成し、2）立体構造をX線結晶回折で解析し、TTXとの結合様式を予測し、3）TTX結合力と結合による毒性への影響を調べることを目的とする。本研究では、イソガニ体液由来でTTXと特異的に結合する構造未知のTTX結合タンパク質（イソガニ体液TTX結合タンパク質）と、トラフグ属血漿由来でTTXだけでなく麻痺性貝毒サキシトキシンとも結合する構造既知のTTX結合タンパク質（pufferfish saxitoxin- and tetrodotoxin binding protein、PSTBP）を対象とする。
研究1年目の本年は、TTX結合タンパク質の組換えタンパク質合成を中心に行った。イソガニ体液TTX結合タンパク質は、構造未知のため、単離精製から行い、精製品の部分アミノ酸配列を解析し、大腸菌による組換えタンパク質の作製を試みた。一方、PSTBPは遺伝子配列が公開されているので、組換え体の遺伝子配列を組み込んだプラスミドを用いて組換えバキュロウイルスを作製し、カイコに感染させて体液中に組換え体を得た。そして、結晶化条件のスクリーニングに必要な純度とタンパク質量の組換え体を得るため、PSTBP2を精製した。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
イソガニ体液TTX結合タンパク質は精製が困難であったが、種々検討の結果、糖鎖アフィニティーおよびイオン交換カラムクロマトグラフィーと分取電気泳動を組み合わせた方法で、TTX結合活性を保持したまま精製することに成功した。精製過程における挙動等から、イソガニ体液TTX結合タンパク質は、分子量88kDa、65kDaおよび26kDaの3つのサブユニットから構成される分子量400kDaの酸性糖タンパク質であることがわかった。イソガニ体液TTX結合タンパク質の一次構造解明のため、精製したTTX結合タンパク質の部分アミノ酸配列分析を行い、これを基にcDNAクローニングでイソガニ体液TTX結合タンパク質の部分塩基配列を明らかにした。当該塩基配列の演繹アミノ酸配列から推定される分子量は前述の65kDaサブユニットと一致したため、65kDaサブユニット成分について組換えタンパク質の作製を行った。すなわち、脊椎動物由来外来タンパク質を大腸菌で発現するため、遺伝暗号使用頻度を大腸菌に最適化した遺伝子断片について、5’末端にSmaI、3’末端にBamHIの制限酵素認識配列を付加したプライマーで増幅した。得られた増幅産物およびタンパク質発現プラスミドベクターpET16bを同酵素で消化し、精製後にT4DNAリガーゼで結合した。これとは別に、トラフグ属フグの血漿に含まれるPSTBPについては、PSTBP2の組換えタンパク質を合成することができた。しかし、合成された組換え体は純度が低かったので、X線結晶回折解析するため、アフィニティクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびにゲル濾過HPLCで順次精製した。その結果、結晶化条件のスクリーニングに必要な純度(90%以上)とタンパク質量(2 mg) の組換え体を得ることができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
イソガニ体液TTX結合タンパク質については、残りのサブユニットについて部分アミノ酸配列分析を行っており、その配列情報からcDNAクローニングを行い、TTX結合タンパク質の一次構造を決定する。そして、それらの遺伝子配列をもとに、イソガニ体液TTX結合タンパク質発現コンストラクトについて最適タンパク質発現条件を決定し、大量に作製する予定である。封入体として得られた場合は、これの可溶化条件について検討を行う。また、65kDaサブユニットについてTTX結合能評価を行い、TTX結合能が確認されたら、高度精製を行い結晶化し、立体構造を明らかにする。並行して、イソガニTTX結合タンパク質の一次構造解明を進め、残りのサブユニットについても同様に組換えタンパク質を作製し、TTX結合能が見られたサブユニットについて高度精製を行い結晶化し、その立体構造を明らかとする予定である。
PSTBPについては、精製が完了したPSTBP2は結晶スクリーニングキットを用いて、結晶が得られる条件を探索する（1次スクリーニング）。結晶が得られた場合は、その近傍の条件で結晶化を行い、X線回折斑点が得られる良質な結晶を取得する（2次スクリーニング）。結晶が得られない場合は、スクリーニングキットの数を増やしていく。2次スクリーニングで得られた結晶は放射光施設でデータを取得し、構造解析を行う。そして、TTXとの結合様式を予測する予定である。PSTBP1については、組換えタンパク質を合成し、精製は高収率が期待されるCoレジンを用いたアフィニティクロマトグラフィー法に変更して行う予定である。精製により高純度の組換えタンパク質が得られたら、PSTBP2と同様の手順で結晶化・構造解析を行う。
|
| Causes of Carryover |
タンパク質の結晶化にはスクリーニングキットを用いるが、今年度は結晶化を行わなかったため、スクリーニングキットならびに関連する試薬類の購入を次年度とした。このため、スクリーニングキットならびに試薬類の購入費用が次年度に繰り越しになった。今年度はイソガニ体液TTX結合タンパク質65kDaサブユニットとPSTBP2の組換えタンパク質がそれぞれ合成できたので、次年度は、今年度の繰り越し分とあわせて結晶化に必要なスクリーニングキットならびに試薬類を購入する予定である。
|
