2019 Fiscal Year Research-status Report

魚類育種事業への新展開ー倍加半数体系統の簡易量産技術開発－

Research Project

Project/Area Number	19K06242
Research Institution	Kindai University
Principal Investigator	小林徹近畿大学, 農学部, 教授 (00298944)
Project Period (FY)	2019-04-01 – 2022-03-31
Keywords	ホンモロコ / 染色体操作 / 卵割阻止 / 二重高温処理 / 倍数性 / 半数体 / 雌性発生二倍体 / 倍加半数体
Outline of Annual Research Achievements	本研究では、魚類養殖に新しい「クローン系統育種」を実現するため、雌性発生胚の卵割阻止を確実かつ高頻度に実現する。「複数回の高温刺激処理」による分裂阻止効果を検討し、その最適処理条件と細胞学的メカニズムを明らかにするとともに、育種素材としての倍加半数体(完全ホモ型単性発生二倍体)の大量作出の実現を目指す。通常発生卵の倍数化処理のタイミングは、20℃培養で媒精後23－25分に第一処理、その終了後15分に第二処理を開始するのが最適と判断され、そのことはAquaculture Research 50, 2666－2686 (2019)に掲載した. さらに、これを倍加半数体作出へ発展させるための以下の諸条件について検討した。①雌性発生卵の発生速度は通常発生卵よりもやや遅れることが判明した。このことは、雌性発生卵から倍加半数体を得るために重要で、通常発生卵の倍数化処理情報をそのまま雌性発生卵に応用できないことを意味するため、今後改めて雌性発生卵への二重高温処理の適正時期を検討する。②卵割阻止のための第一、第二の各1分間の処理温度を40.0℃、40.5℃、41.0℃の間で比較した結果、孵化率、孵化仔魚の四倍体の割合がいずれも高値を示した40.5℃が適正と判断された。③雌性発生誘導条件は、かつて発生個体の形態や生存性のみで判定されてきたが、改めて発生個体の倍数性を正確に判定することで、精子の遺伝的不活性化効果と媒精卵の雌性発生誘導について調べた。孵化仔魚は、正常形態なのに半数体であることも、奇形であっても二倍体であることもあった。倍数性は形態のみでは正確に判断できないので、今後倍数性は細胞の相対DNA量で判定し、適正な誘導条件を精査せねばならない。誘導できる半数体の割合と孵化までの生存率を考慮すると、雌性発生誘導のためのUV照射量は2000 erg/mm2程度が有効であると考えられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 通常発生と雌性発生の発生速度の比較　通常発生区では受精後25分に第一核分裂(1cd)前期が開始、中期は40分～50分、終期は50分～60分であった。雌性発生区では前期の開始は受精後30分、中期は45分～55分、終期は55分～65分であった。第二処理直前(受精後41分)は、通常発生卵(第一処理済み)は1cd前中期の後半または中期、雌性発生卵(第一処理済み)は1cdの中期であった。よって、本種の雌性発生卵における卵割阻止処理時期は、通常発生の場合(受精後23－25分、および41分)よりやや遅いと考えられた。高温処理の強度　第一処理は媒精後25分、第二処理は媒精後41分に限定し、各1分間の高温処理温度40.0℃、40.5℃、41.0℃の間で、通常発生卵の生存率、倍数化効果への影響を比較した結果、二重処理区の孵化率は40.0℃、41.0℃で15.3%、22.6%と、40.5℃(36.4%)より低くなった。これらの孵化仔魚の倍数性は、40.5℃、41.0℃でそれぞれ74%、73%(最大97%)と高率を示した。従って、処理強度は40.5℃が適正と判断された。雌性発生誘導の精査　孵化仔魚の形態と倍数性を調べたところ、対照区(未照射精子による媒精)では2倍体が95.5％で、半数体は検出されなかった。100 erg/mm2以上の紫外線照射区では半数体が80％前後を占めた。これらは、「正常形態」でも半数体を0.8％含み、さらにこれまで形態特徴で半数体と判定された「奇形」にも半数体以外に二倍体や三倍体が6.5％含まれていた。誘導できる半数体の割合と生存率から、雌性発生誘導のためのUV照射量は、2000 erg/mm2程度が有効と考えられた。また、倍数化処理を施し、二倍体となった雌性発生個体に形態異常が頻出した。これらの多発防止が今後の大きな課題である。
Strategy for Future Research Activity	雌性発生ホンモロコ卵への二重高温処理の至適タイミングの検討　(第一処理)紫外線照射による遺伝的不活性化精子(UV精子)を一腹卵に媒精し20℃で培養した受精卵に対し、受精後23、25、27、29、31分のいずれかに40.5℃1分間の第一処理を施す。第二処理は、第一処理終了15分後から開始する。これらの各実験区の孵化仔魚各個体の形態、倍数性、および各処理直前の卵の細胞分裂段階を判定し、これらから第一処理の適正タイミングを検討する。 (第二処理)第一処理の場合と同様にUV精液で雌性発生を誘起し、水温20℃で培養した受精卵に対し、受精26分後に第一処理を、さらに第一処理終了から10, 12.5, 15, 17.5, 20, 22.5, 25分後のいずれかに第二処理をそれぞれ施す。処理後は20℃で培養を継続し、孵化仔魚各個体の形態、倍数性を判定し、第二処理の適正タイミングを検討するとともに、各処理直前の卵の細胞学的時期を特定する。マイクロサテライト遺伝子分析による発生個体の生成機序の検討　雌性発生実験で二倍体と判定された個体の複数のマイクロサテライト遺伝子座の遺伝子型を調べ、倍数化されたと判断した各個体の生成機序を判定し、各処理条件における見かけではない真の倍加半数体の作出効率を評価する。細胞学的解析による卵割阻止メカニズムの解明　高温刺激処理による中心小体の破壊および母中心小体からの娘中心小体の複製について、中心小体を分染するcentrin抗体と母中心小体を判別するCEP170抗体の2種類の抗体を用いて免疫組織学的観察を試みる。多回高温処理による作出仔魚の形態異常発生への防止効果の検討　倍数化率をいくら極めても生存性のある倍加半数体の生産に繋げられなければ、産業的には大きな意味を持たない。健常な倍加半数体の高効率な生産のために、様々な条件で多回高温処理を試みる。