2019 Fiscal Year Research-status Report
塩ストレス応答・耐性機構を活性化するダイズ機能未知遺伝子の分子生物学的研究
| Project/Area Number |
19K06330
|
|---|
| Research Institution | Ibaraki University |
|---|
Principal Investigator |
小島 俊雄 茨城大学, 農学部, 准教授 (70311587)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2022-03-31
|
| Keywords | ダイズ / 塩ストレス / 耐塩性 / 機能未知遺伝子 / アルマジロリピート / ユビキチン－プロテアソーム |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は、ダイズの機能未知遺伝子GmTDF-5が作用する塩ストレス応答機構を特定し、転写レベルだけでなく、ユビキチン-プロテアソームによる翻訳後分解制御を受けるGmTDF-5による耐塩性形質の活性化プロセスを解明することを目的としている。
2019年度の研究成果として、(1) GmTDF-5プロモーターGUS発現系を導入したシロイヌナズナを用いたヒストケミカルアッセイにより、塩ストレス処理後、時間の経過とともに地上部器官（茎の基部や葉脈など）で強いGUS活性が確認され、対照的に塩ストレスに直接さらされている根では全く活性が見られないことを明らかにした。この結果は、GmTDF-5が作用する塩ストレス応答・耐性機構が地上部の特定の組織に限定されていることを示唆している。(2) GmTDF-5ホモログをもたないシロイヌナズナを用いた解析だけでなく、同遺伝子を有するモデル植物を用いた実験系を構築するため、ナス科のモデル植物タバコにおける分子生物学的研究を展開した。その結果、タバコはGmTDF-5ホモログを二つ有しており、推定されるタンパク質の両者の配列相同性は95%と高かったが、各組織における塩ストレスへの応答性に違いが見られ、組織特異的に機能が使い分けられている可能性が示された。
今後は、網羅的遺伝子発現解析によるGmTDF-5が活性化する内在遺伝子群の特定、シロイヌナズナとタバコを用いたGmTDF-5と結合するタンパク質の探索を進め、GmTDF-5が制御する耐塩性形質を明らかにしたい。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
(1) GmTDF-5が作用する耐塩性機構の局在組織・器官の特定：GmTDF-5プロモーターGUS発現系を導入した形質転換シロイヌナズナを用いてヒストケミカルアッセイを実施した結果、塩ストレス処理後、地上部器官では茎の基部、葉脈におけるGUS活性が時間の経過とともに増加したが、根では塩ストレス処理前から一定して活性が見られなかった。地上部において気孔やトライコームでのGUS活性は見られなかったが、葉の周辺において局所的に活性の高いところが存在した。
(2) GmTDF-5が活性化する遺伝子群のリスト化と耐塩性形質の特定：GmTDF-5を過剰発現するシロイヌナズナを用いたRNAシークエンスを計画しているが、同タンパク質の発現状況を調べた結果、当初使用する予定だった系統に比べ、より適したものが見つかった。そこで新しい系統のGmTDF-5転写量や翻訳量を詳細に調査し、RNAシークエンスに向けた準備を進めた。
(3) GmTDF-5と結合するタンパク質の同定とGmTDF-5応答遺伝子群の活性化における作用機序の解明：GmTDF-5を発現する植物を用いた共免疫沈降法を実施するため、同遺伝子を過剰発現するシロイヌナズナを用いた方法を計画したが、その発現量から結合タンパク質を多量に集めることが難しいケースも想定される。そこで同実験と並行してGmTDF-5ホモログをもち植物個体が大きいモデル植物タバコを用いた実験系も構築することにした。この実施に向けて、タバコがもつGmTDF-5ホモログの分子構造と塩ストレスに対する組織特異的応答性を詳細に特徴付けし、第37回日本植物細胞分子生物学会（京都）大会で報告した。
以上の研究成果及び準備状況から「おおむね順調に進展している」と評価した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
2020年度は、次の3項目を重点的に解析する。
(1) GmTDF-5が作用する耐塩性機構の局在組織・器官の特定：ヒストケミカルアッセイにより明らかにしたシロイヌナズナGUS発現部位の組織切片を作成し、GmTDF-5が作用する塩ストレス応答・耐性機構が局在する組織部位を突き止める。
(2) GmTDF-5が活性化する遺伝子群のリスト化と耐塩性形質の特定：GmTDF-5を過剰発現するシロイヌナズナに対してRNAシークエンスによる網羅的遺伝子発現解析を実施し、GmTDF-5が活性化する内在遺伝子群を特定・リスト化する。候補遺伝子群の転写量はリアルタイムPCRにより再評価し、GmTDF-5が内在遺伝子群の発現に与える影響とその遺伝子機能から関連する耐塩性形質を突き止める。
(3) GmTDF-5と結合するタンパク質の同定：GmTDF-5を過剰発現する形質転換シロイヌナズナ及びタバコに対して抗GmTDF-5抗体などを用いた共免疫沈降法を実施し、GmTDF-5及びそのホモログと結合するタンパク質を特定する。
|
| Causes of Carryover |
当初予定していたRNAシークエンス解析を実施しなかったため（当初使用する予定だった系統より適したものが見つかったため）。次年度使用額は、2020年度に実施するRNAシークエンス解析費用に充てる。
|
Research Products
(1 results)
