2019 Fiscal Year Research-status Report
Studies of chitin degradation mechanism of Paenibacillus sp.
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19K06340
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| Research Institution | Fukui Prefectural University |
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Principal Investigator |
伊藤 貴文 福井県立大学, 生物資源学部, 准教授 (10402827)
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| Project Period (FY) |
2019-04-01 – 2023-03-31
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| Keywords | Chitin / beta-glucosidase / alginate / alginate lyase |
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| Outline of Annual Research Achievements |
キチンなど多糖は生物が作る再生可能な資源である。本研究では、その有効利用のために、「Paenibacillus属細菌によるキチン分解の制御機構の解明」を行っている。本年度は、下記の研究を実施した。
(1) キチンオリゴ糖の細胞内への取り込みと分解に関わるタンパク質・酵素の解析 (beta-グルコシダーゼ (NagZ) の諸性質の決定)
これまでにPaenibacillus属細菌 FPU-7株がbeta-グルコシダーゼ (NagZ)を利用して、細胞質内に取り込まれたキチンオリゴ糖を単糖にまで分解することを見出している。本年度は、NagZの大腸菌による組換えタンパク質を調製し、その酵素学的諸性質 (基質特異性、至適温度、至適pH、熱安定性等) および立体構造 (beta-サンドイッチとTIM-バレルから形成) を決定した (Itoh et al., J. Biochem. 166, 503-515, 2019.)。そして、本酵素が細胞質内でキチンオリゴ糖代謝に関わっているだけでなく、細胞壁多糖のリサイクルにも関与していることが示唆された。今後、GlcNAc単糖生産用酵素としての利用、あるいは、糖転移活性を利用したキチンオリゴ糖生産酵素としての利用も検討する。
(2) 新規なアミノ酸配列をもつアルギン酸分解酵素 (AlgL) のX線結晶構造解析
これまでにP. PFU-7の培養液から新規アルギン酸分解酵素 (AlgL) を見出している。本年度は、本酵素の酵素学的諸性質 (基質特異性、至適温度、至適pH、熱安定性等) や立体構造 (beta-ヘリックス構造) を決定した (Itoh et al., Sci. Rep. 9, 14870, 2019)。今後、AlgLによるアルギン酸オリゴ糖の簡易調製法の確立とオリゴ糖の植物に対する効果を解析する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度、下記の成果を得た。おおむね当初の研究計画のとおりである。
(1) キチンオリゴ糖の細胞内への取り込みと分解に関わるタンパク質・酵素の解析
本年度は、Paenibacillus属細菌 FPU-7株由来beta-グルコシダーゼ (NagZ)の組換えタンパク質を調製し、その酵素学的諸性質 (基質特異性、至適温度、至適pH、熱安定性等) および立体構造 (beta-サンドイッチとTIM-バレルから形成) を決定した (Itoh et al., J. Biochem. 166, 503-515, 2019.)。そして、本酵素が細胞質内でキチンオリゴ糖を単糖にまで分解することで、キチン代謝に関わっていることが示された。さらに、立体構造解析によって、本酵素が細胞壁多糖のリサイクルにも関与していることを示唆するデータが取得された。今後、本酵素の生理的機能の解析を進めるだけでなく、GlcNAc単糖生産用酵素としての利用、あるいは、糖転移活性を利用したキチンオリゴ糖生産酵素としての利用も検討する。
(2) 新規なアミノ酸配列をもつアルギン酸分解酵素 (AlgL) のX線結晶構造解析
本年度は、P. PFU-7培養液中に含まれる新規アルギン酸分解酵素 (AlgL) の酵素学的諸性質 (基質特異性、至適温度、至適pH、熱安定性等) や立体構造 (beta-ヘリックス構造) を決定した (Itoh et al., Sci. Rep. 9, 14870, 2019.)。そして、その立体構造に基づき、新規なアルギン酸リアーゼの反応機構を提案することができた。また、AlgLを用いることによって、不飽和アルギン酸3～5糖を大量に調製できた。今後、簡便なオリゴ糖生産方法の確立と、生産したアルギン酸オリゴ糖の植物に対する効果を解析する。
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| Strategy for Future Research Activity |
下記、交付申請書の通り、研究を進めていく。
(1) キチン分解に関わる遺伝子の発現を制御する機構の解析 (二成分制御系の解析): P. PFU-7の一部のキチン分解酵素は、キチンオリゴ糖によって発現が誘導される。これまでにキチンオリゴ糖結合タンパク質 (NagB1) とオリゴ糖加水分解酵素 (NagZ) 近傍の配列に遺伝子発現制御系の一つである二成分制御系のタンパク質複合体 (NagSとNagR) を見出している。今後、NagB1とNagZと二成分制御系 (NagSとNagR) がキチンオリゴ糖をシグナルとして協奏的に機能を果たしているのか、RT-PCRによる転写解析およびウエスタンブロッティングによる翻訳解析によって確認する。さらに、NagR (レスポンスレギュレーター) が相互作用する塩基配列をクロマチン免疫沈降法とDNAシーケンスによって網羅的に同定する予定である。そして、P. FPU-7あるいは近縁種を有用物質の生産菌として利用できるように、タンパク質の発現制御法への展開を図る。
(2) 細胞表層発現タンパク質の網羅的解析: P. FPU-7の細胞表層に存在するタンパク質を質量分析装置を利用して網羅的に同定する。培養条件や時期によるタンパク質の発現の差異を解析することで、二成分制御系以外にも、キチン分解やその制御に関わるタンパク質を探索する。また、同時に細胞壁の構築や細胞増殖に関わるタンパク質の知見も得られることも予想され、P. FPU-7や近縁種による有用物質の効率的な生産方法の確立にも期待される。
(3) アルギン酸分解酵素 (AlgL) が生産するオリゴ糖の生理機能の解析: AlgLによって生産されるアルギン酸オリゴ糖 (3、4、5糖) の植物に対する効果をイネ培養細胞の活性酸素の発生量、植物の根や茎の伸長効果や感染特異的タンパク質の発現量から解析する。
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| Causes of Carryover |
2021年度物品費として利用する。
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